注意！研究发现微生物扩增子相对定量测序可能会产生误导性结果

原创上海天昊生物

英文题目：Relative Abundances of Species or Sequence Variants Can Be Misleading: Soil Fungal Communities as an Example

中文题目：物种或序列变异的相对丰度可能会产生误导：以土壤真菌群落为例

期刊名：Microorganisms

影响因子：4.122

文章摘要

相比于传统的单一栽培农田而言，可持续的植物生产系统是未来农业发展的方向。农林业（Agroforestry）具有众多的环境效益，是最有希望的替代方法之一。尽管土壤真菌是植物生产力和生态系统过程的关键驱动力，但在温带农林系统中对这些微生物的研究很少，使得人们对农林实践下的农业系统的理解不完整。在这里，研究者通过扩增子测序评估了土壤真菌群落的组成和多样性，以及以温带杨树为基础树行间种植农作物(农林)和单作农田系统中真菌类群的频率(相对丰度)。使用从扩增子测序获得的物种或ASV的相对丰度分析微生物组忽略了微生物群的大小，这会导致一系列问题。因此，本研究检测了所选真菌类群的绝对丰度以及真菌总种群规模。树行强烈影响群落组成，增加了土壤真菌的种群数量和物种丰富度。此外，树行对外生菌根起到强烈的促进效果。研究者推测菌根提高了未施肥的树行的养分获取，从而有助于系统的总生产力。相对和绝对丰度的比较揭示了显著的差异，强调了仅靠扩增子相对定量测序不能充分评估菌群规模和动态。本研究结果强调了将基于扩增子测序的相对丰度数据与绝对定量相结合的必要性。

背景介绍

农林业（Agroforestry）是一种将作物和树木结合起来的替代性农业用地，采用作物与树木交替种植方式，是一种流行的复合农林业。与传统的单一栽培农田相比，农林业的主要优势是其在树木和作物之间互补利用资源的潜力，这最终导致系统更高的资源利用效率。最近的研究表明，对农林复合系统和单一栽培的农田作物进行相比，发现以杨树为基础的农林复合系统可以增加土壤中细菌与真菌的比率及丰富度。

尽管土壤真菌群落包括许多有益的植物共生体、病原体及其拮抗剂，并且是生态系统过程的关键驱动因素，但温带农林系统土壤真菌群落的研究还是较少。本研究旨在利用扩增子相对定量测序和绝对定量技术，来调查德国三种杨树混作系统(农林-耕地系统)土壤真菌群落的组成、丰度和多样性。

实验方法

本研究是在德国的三个成对的农林业和传统的单一栽培农田进行的(图1A)。农林系统是2007年至2010年建立的以杨树为基础的树行区域种植系统。同一杨树是在每个地点用插条人工种植的。12米宽的杨树行是南北向的，与48米宽的农作物行交替排列，在每个地点，农林复合系统和单一耕作农田系统都建立了四个重复地块(图1B)。

图1、农林复合系统和单作农田的取样地点和研究设计示意图。(A，C-E)研究地点位置，具体为德国的Calcaric Phaeozem、Gleyic Cambisol和Vertic Cambisol区。（B）土壤样本取样图。温带农林耕地的每个重复地块内的土壤样本是在树木行的中心以及距离树木1、7和24米的作物行收集的。在单一栽培的农田中，在每个重复地块的中心收集土壤样品。

在每个地点的20个采样点采集了顶部5 cm深度的土壤样本，共计60个样本，之后低温运送到实验室后，进行标准化DNA提取，使用qPCR来检测抑制物质对扩增的影响，之后进行标准化文库制备和Illumina测序，利用QIIME 2进行数据分析。绘制了分级二次采样(SRS)曲线(图2)。土壤真菌的绝对定量使用qPCR方法进行测定，研究者进一步还选取10个真菌属/种进行绝对定量检测。

图2、SRS曲线和用于使用SRS进行标准化的序列计数数量。AF =农林系统，ASV =扩增子序列变异体。

实验结果

土壤真菌的群落组成和多样性

获得的4969个真菌ASVs包括14个真菌门，其中子囊菌门、担子菌门和被孢霉门数量最多。最丰富的三个纲是粪壳菌纲、座囊菌纲和伞菌纲(图3A)。最丰富的科是赤壳科和被孢霉科(图3B)。

图3、农林复合系统和单一栽培农田系统中土壤优势真菌(A)纲和(B)科的相对丰度。

使用NMDS和CAP对群落构成的分析表明土壤真菌群落的组成主要受地点影响，然后是采样位置(图4A，B)。此外，两种排序方法都表明，农林系统的作物行和单作农田之间的差异可能是取样地点之间群落组成差异的原因(图4A，B)。

图4、农林复合系统和单作农田系统中土壤真菌群落的β多样性。

图5、土壤真菌群落的α多样性及其与树行的相关性。(A–C)真菌ASV的α多样性检测。使用线性混合效应模型测试采样位置之间的差异(作物行内的树行，距离树行1米、7米和24米)。(D–F) Spearman分析检测α多样性与树行距离的相关性。

土壤真菌分类群绝对丰度和相对丰度的比较

土壤真菌在树行中比在农田(农林作物行和常规单一栽培农田)中更丰富，并且它们的丰度随着与树木的距离增加而降低。在树行土壤中的担子菌门的相对和绝对丰度大于在耕地土壤中(图6C，D)。虽然与耕地相比，子囊菌亚门的绝对丰度在树下有所增加(图6B)，但其相对丰度在树行中低于耕地(图6A)。

图6、子囊菌和担子菌在不同采样点的相对丰度（A, C）和绝对丰度（B, D）。

链格孢属在单一农田中的相对丰度和绝对丰度都大于在树行中的相对丰度 (图7A)。在树行中比在作物行和单作系统中1米和7米的距离低(图7B)。杨树行的建立不影响枝孢属的相对和绝对丰度(图7C，D)。木霉菌的相对丰度在树行比单一农田低(图7E)，绝对丰度树行大于单一农田(图7F)。镰刀菌的相对丰度在树行中低于耕地(图8A)，并且与离树行的距离呈正相关(图8B)。

图7、链格孢属、枝孢属和木霉属在不同采样点的相对丰度和绝对丰度。

图8、镰刀菌相对丰度以及与树行距离的相关性。

研究结论

农林耕地系统中的树行增加了土壤真菌的种群规模和物种丰富度。种群数量和物种丰富度都随着离树行距离的增加而下降。在微生物组的相对丰度和绝对丰度之间发现的巨大差异表明，不能单纯通过常规的扩增子相对定量测序来评估种群规模和动态。这些结果强调了将扩增子相对定量测序与绝对定量以及总微生物种群规模相结合的重要性。

常规扩增子测序技术和qPCR技术技术痛点

常规16S、ITS扩增子测序技术虽然其具有高通量，低花费，可客观还原菌群结构及相对丰度比例的巨大优势，但是其是通过某一OTU分类单元的序列数所占总序列数的比值来获得某个细菌或真菌的相对丰度比例信息，然而相对丰度信息不能反映样本中物种真实的绝对丰度情况，例如微生物某一类群的相对丰度比例增加不一定真正是相应微生物类群的绝对丰度增加，可能是其它微生物类群的绝对丰度减少是导致其在群落结构中相对丰度比例的增长，因此常规16S和ITS扩增子测序技术基于相对定量分析的错误结果解释可能导致假定的因果关系！

qPCR绝对定量技术虽然可以进行物种绝对定量分析，但是qPCR定量实验结果常常不稳定，且特定物种qPCR需要设计特定引物，对引物特异性要求较高，且引物优化难度较大，导致常规的qPCR绝对定量实验不再适用于组成较为复杂的环境样本微生物绝对定量。此外，当环境样本中往往含有腐殖酸，这些腐殖酸会通过抑制酶的活性抑制PCR，从而影响qPCR对细菌和真菌拷贝数定量结果的准确性。

天昊生物Accu16S^TM细菌绝对定量测序技术简介

本技术是一种将qPCR绝对定量技术和常规16S和ITS扩增子测序技术合二为一的技术，该技术不但可以进行Alpha多样性分析、群落组成分析、Beta多样性分析、指标和微生物相关性分析等常规16S和ITS扩增子测序分析，关键可以解析样本中总细菌的绝对拷贝数，还可以解析样本中每个物种的绝对拷贝数，因而对微生态学内许多悬而未决的问题具有进一步阐明的潜力。此外，该技术进行细菌和真菌拷贝数定量时，构建标准曲线的内标和样本DNA是在同一个样本孔中一起进行PCR反应，所以PCR反应效率相同，然后上机测序。因此校正了腐殖酸对PCR的影响，避免了腐殖酸等PCR抑制物对样品细菌16S和真菌ITS拷贝数定量的影响，因此针对土壤、水体和淤泥等环境样本以及粪便等医学样本，天昊生物16S和ITS扩增子绝对定量测序技术计算得到的细菌16S和真菌ITS拷贝数相对于qPCR更准确。

天昊生物Accu16S^TM细菌绝对定量测序技术发表文章情况