技术简介
环状RNA(circRNA)是一类区别于传统的线性 RNA分子，不具有5’端帽子和3’端 poly(A)尾巴，以共价键形式头尾相连形成圆环结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。circRNA广泛存在于动植物中，具有物种保守性和组织特异性。circRNA功能众多，可充当miRNA海绵竞争结合miRNA，发挥ceRNA的功能调节基因表达。通过二代测序和生物信息分析鉴定出来的circRNA是否真实存在，需要通过实验进一步验证。
针对circRNA和其来源线性RNA(mRNA)分别设计特异性引物Divergent Primer（发散引物）和Convergent Primer（收敛引物），以cDNA和gDNA为模板进行PCR扩增，根据目的条带的有无判断序列是否为circRNA，进一步通过Sanger测序确认Junction reads。RNase R消化Total RNA，以RNase R(+)和RNase R(-)为模板进行qPCR扩增分别检测circRNA和线性RNA的丰度，验证circRNA耐受RNase R消化的特性。
技术参数
1.提供胶图、Sanger测序原始峰图文件、qPCR原始数据文件
2.每个circRNA设计2对引物（Divergent Primer和Convergent Primer）
3.每个circRNA进行4个PCR验证与琼脂糖电泳，1个反应的Sanger测序
4.RNaseR耐受实验，每个circRNA提供12个qPCR检测反应，2对引物× 2（RNase R处理前后）× 3重复
数据展示
图1 RT-PCR琼脂糖凝胶电泳图
图2 Sanger测序图
图3 RNase R消化前后circRNA和linear RNA相对表达量
技术路线
样品要求与建议
RNA
1.样品类型：完整无基因组DNA污染的Total RNA
2.样品需求量：Qubit检测，要求浓度≥100 ng/μL；总量≥3 μg
3.样品完整度：琼脂糖凝胶电泳图18S、28S条带清晰，无挂孔
4.每个离心管用parafilm膜密封，干冰运输（-70℃），保证运输途中干冰不会完全融化
5.如需进行核酸抽提，样本需符合天昊生物所要求的样本类型、保存及送样条件，详见《天昊生物组织送样要求与建议》；
DNA
1.样品需求量：Qubit检测，要求浓度Qubit≥10 ng/ul；总量≥100 ng
2.样本完整度：琼脂糖凝胶电泳图基因组DNA条带清晰，无明显降解
3.如需进行核酸抽提，样本需符合天昊生物所要求的样本类型、保存及送样条件，详见《天昊生物组织送样要求与建议》；
分析与结果
1.Sanger测序峰图，展示circRNA junction位点附近的序列
2.琼脂糖凝胶电泳图，展示待检测circRNA分别以对应的cDNA和gDNA为模板，Divergent Primer和Convergent Primer为引物的PCR结果
3.RNase R消化前后相对表达量柱状图，展示待检测circRNA和线性mRNA参照（默认为GAPDH和待检测circRNA对应的mRNA）在RNase R线性消化前、后，特异性检测引物的相对表达量，以RNase R消化前的表达量为100%进行校正。特异性引物对于circRNA使用Divergent Primer，对于线性mRNA使用Convergent Primer
相关文献
Panda, A. C. & Gorospe, M. Detection and Analysis of Circular RNAs by RT-PCR. Bio Protoc 8, doi:10.21769/BioProtoc.2775 (2018).
常见问题
问1：circRNA鉴定时RNase R消化是否必须做？为什么需要DNA?
答1： circRNA鉴定时推荐做RNase R消化。 circRNA鉴定首先以cDNA为模板，使用Divergent Primer进行RT-PCR扩增，得到预期条带后对PCR产物进行Sanger测序，剪接位点处的序列正确则证明circRNA真实存在；增加gDNA的对照实验，使用Divergent Primer和Convergent Primer检测cDNA和gDNA模板，Divergent Primer在cDNA可以正常扩增，在gDNA无法扩增，而Convergent Primer在cDNA和gDNA中均能扩增，所以根据目的条带的有无进一步鉴定circRNA；接着可以增加RNase R的抵抗实验，设置RNase R组和Control组，RNase R组中对Total RNA进行RNase R消化，Control组不进行RNase R消化，使用Divergent Primer和Convergent Primer检测RNase R组和Control组的cDNA模板，在RNase R组中线性RNA的扩增条带变淡甚至扩不出来，而circRNA的扩增条带变化不明显，验证了circRNA耐受RNase R消化的特性。
问2：为什么有时RNase R消化后circRNA的相对表达量升高了很多？
答2：明确一点，这是circRNA耐受RNase R消化的验证实验。Total RNA经RNase R消化后circRNA的相对比例会上升，模板复杂度降低，可能会导致circRNA的逆转录和PCR扩增效率提高，进而出现RNase R消化后circRNA的表达量相对消化前升高的情况(见下图)。
问3：circRNA qPCR相对表达量检测计算时有没有内参或者外参？
答3：通过与线性内参RNA表达量进行比较，实验样本不经过RNase R消化，用ΔCt法对目的circRNA基因进行相对定量，ΔCt=Ct(目的基因) - Ct(内参基因)，相对表达量=2^（-ΔCt）。目前没有添加外参进行表达量计算的方案。
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