技术简介
环状RNA(circRNA)是一类区别于传统的线性 RNA分子，不具有5’端帽子和3’端 poly(A)尾巴，以共价键形式头尾相连形成圆环结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。circRNA广泛存在于动植物中，具有物种保守性和组织特异性。circRNA功能众多，可充当miRNA海绵竞争结合miRNA，发挥ceRNA的功能调节基因表达。相比于只进行rRNA去除的常规circRNA-seq，线性消化circRNA-seq针对circRNA建库，减弱了线性RNA的干扰，大大提高了cirRNA的检出数量和测序数据可靠性，为专注于circRNA的研究提供了有力支持。
技术参数
提供illumina 2×150bp测序数据
1.数据量≥ 12G raw data/样本
2.Q30 >80%
3.rRNA比例低于rawdata 的5%
数据展示
图1 常规circRNA-seq(RNase R(-))和线性消化circRNA-seq(RNase R(+))circRNA检出数量
图2 常规circRNA-seq(RNase R(-))和线性消化circRNA-seq(RNase R(+))circRNA检出数量Venn图
图3 常规circRNA-seq(RNase R(-)) circRNA表达量相关性(Expression>1)
图4 线性消化circRNA-seq(RNase R(+))circRNA表达量相关性(Expression>1)
技术路线
样品要求与建议
1.样品类型：完整无基因组DNA污染的Total RNA
2.样品需求量：Qubit检测，要求浓度≥100 ng/μL；总量≥4 μg
3.样品完整度：Agilent 2100 Bioanalyzer 检测RIN值≥6.5
4.每个离心管用parafilm膜密封，干冰运输（-70℃），保证运输途中干冰不会完全融化
5.如需进行核酸抽提，样本需符合天昊生物所要求的样本类型、保存及送样条件，详见《天昊生物组织送样要求与建议》
分析与结果
1.原始测序数据预处理
2.数据质量过滤
3.比对到参考基因组及结果评估
4.circRNA预测
5.circRNA来源基因注释
6.circRNA表达定量与统计
7.circRNA差异表达分析
8.差异circRNA来源基因GO/KEGG富集分析
9.miRNA结合位点预测与ceRNA机制解析
10.circRNA与mRNA关联分析
相关文献
Sekar S, Geiger P, Cuyugan L, et al. Identification of circular RNAs using RNA sequencing[J]. JoVE (Journal of Visualized Experiments), 2019 (153): e59981.
常见问题
问1：是否可以在RNaseR消化后不经过rRNA去除直接建库以降低成本？
答1：实验上可以操作，但不能保证rRNA的占比以及文库质量。
问2：数据分析时circRNA定量的方法？
答2：数据分析使用CIRCexplorer2软件检测样本中circRNA的表达量，以测序reads数(count)表示，之后使用DESeq2均一化处理进行表达量的校正。
问3：测序报告中表达量最低为多少可以进行circRNA的鉴定？
答3：目前做过测序数据中表达量最低为11（DESEQ2表达量）的qPCR检测，可以正常扩增。
咨询热线：400-065-6886
