喜讯！天昊Accu16S细菌绝对定量技术助力客户股骨头坏死研究登陆Science子刊《Science Advances》

近日，中南大学湘雅医院骨科谢辉教授团队在国际顶级期刊《Science Advances》上发表了重要研究成果。该项研究发现，GC可以导致宿主肠道有益菌Lactobacillus animalis及其胞外囊泡减少，这与股骨头坏死的发病相关。

在本研究中，天昊生物提供微生物Accu16S^TM细菌绝对定量测序及相关分析服务。

中文题目：糖皮质激素诱导的肠道有益菌胞外囊泡的减少与骨坏死发病相关

期刊名：Science Advances

发表时间：2022年4月13日

影响因子：14.136
 

    本研究以3月龄C57BL/6J雄性小鼠为实验对象，每周的前3天给小鼠大腿肌肉注射甲泼尼龙（MPS）(20 mg/kg/d)，持续处理3周，以诱导GC性ONFH，同时以DMSO处理的小鼠作为健康对照。为了评估同窝饲养对股骨头的影响，研究人员将MPS处理组小鼠和对照组小鼠共居饲养，未同窝饲养的小鼠作为对照。通过一系列实验，研究人员详细探讨了与健康小鼠同窝饲养是否可以保护股骨头免受GC诱导的骨坏死。

研究者在MPS和对照处理后，收集同窝饲养或非同窝饲养小鼠的粪便，利用天昊生物微生物Accu16S^TM细菌绝对定量测序（V3V4区段），来筛选可能与GC诱导ONFH相关的候选细菌，并在此基础上通过移植候选细菌来检测是否能影响小鼠GC诱导的ONFH。研究者还利用显微计算机断层扫描(μCT)分析、血管造影术、组织染色分析、成骨分化试验、细胞凋亡分析、qRT-PCR和蛋白质组等方法，深入分析不同处理，特别是来自特定肠道细菌的EVs是否可以进入股骨头对GC处理小鼠的骨微结构、骨形成活性、血管生成和细胞凋亡发挥调节作用，并鉴定了这些EVs中富含的功能蛋白。
 

1、与健康小鼠同窝饲养可防止GC处理过的同笼小鼠出现ONFH

研究人员将MPS处理组小鼠常规饲养或与溶剂处理组对照组小鼠同窝饲养，6周后对各组小鼠股骨头骨表型进行评估，包括骨微结构、组织学形态、血管体积、血管内皮细胞（CD31阳性）数目、成骨细胞（OCN阳性）数目和凋亡细胞（TUNEL阳性）数量。结果显示，相对于常规饲养的MPS处理小鼠，与溶剂处理的健康对照小鼠同窝饲养的MPS处理小鼠其ONFH表型明显减轻，表现为股骨头骨微结构破坏程度减低和骨量增多、空骨细胞陷窝减少、血管体积和血管内皮细胞数量增加、成骨细胞数量增多和凋亡细胞数量减少。这提示健康对照小鼠可能在同窝饲养过程中向MPS处理组小鼠传递了一些对骨骼健康有利的肠道菌。

2、来自正常小鼠的GM缓解由GC导致的ONFH

接下来，研究人员向MPS处理组小鼠每周灌胃一次健康小鼠的GM，来研究是否会对股骨头产生类似的有益作用。正如预期的那样，小鼠股骨头骨表型进行评估显示，移植来自溶剂处理的健康小鼠的GM可使MPS处理组小鼠的骨质破坏显著减轻。

3、与健康小鼠同窝饲养抑制GC导致的L.animalis减少，移植L. animalis可对抗GC导致的ONFH

为探寻健康小鼠GM中的骨骼健康有益菌，研究者收集了来自常规培养和同窝培养的MPS和对照处理雄性小鼠的粪便样品，进行了微生物Accu16S^TM细菌绝对定量测序。结果显示，MPS处理导致粪便微生物群中观察到的OTUs数量和多样性指数(Chao1和ACE)呈下降趋势，但在与对照处理的小鼠同窝饲养的MPS处理小鼠粪便中，群落丰度的下降被逆转（图A）。与对照处理的健康小鼠或MPS处理的小鼠同窝饲养导致其大多数同笼小鼠中粪便总细菌的绝对丰度增加(图B)。在属水平上，与对照处理的小鼠相比，MPS处理导致乳酸杆菌属（Lactobacillus）的相对和绝对丰度减少。在物种水平上，与对照处理相比，MPS处理的小鼠的粪便微生物群中的动物乳杆菌（L. animalis）和肠乳杆菌（Lactobacillus intestinalis）减少(图D)。然后，研究者在使用qRT-PCR来比较对照和MPS处理的小鼠粪便微生物群中L. animalis的丰度时发现，在施用后1周，MPS诱导L. animalis的丰度显著降低，并且在处理后2周和3周，L. animalis维持在非常低的水平(图E)，这进一步表明GC施用后L. animalis的生长受到抑制。这些结果表明，L. animalis可能是介导来自健康小鼠GM对GC导致ONFH的骨保护作用的关键有益微生物。

研究者通过口服法每周给小鼠移植一次L. animalis，持续6周处理，探讨能否保护小鼠免于GC导致的ONFH(图F-P)。经口服L. animalis后，健康小鼠表现出更高的血管和成骨细胞丰度以及股骨头中更低数量的凋亡细胞(图M-P)。这些发现表明，在正常或GC导致的骨坏死条件下，L. animalis可以促进血管形成，增加骨生成，抑制细胞凋亡，并改善股骨头的骨小梁微结构。

摘自原文图3：与健康小鼠同窝饲养缓解了GC导致的L. animalis减少，移植L. animalis可对抗GC导致的ONFH。

4、肠道L. animalis胞外囊泡（EVs）对血管生成、成骨和凋亡的直接作用

研究者从L. animalis的培养基(CM)中分离出EVs，并研究这些EVs(L. animalis -EVs)对血管生成、成骨和凋亡的直接作用。结果表明，L.animalis-EVs可以进入内皮细胞、骨细胞、成骨前体细胞和骨髓间充质干细胞（BMSCs），直接增强内皮血管生成，促进BMSCs成骨，抑制GC诱导的细胞凋亡，并且可以刺激内皮细胞和骨细胞分泌促血管生成因子。

5、L. animalis-EVs进入股骨头并减缓GC导致的ONFH

为了研究L. animalis-EVs处理是否可以缓解GC导致的ONFH，研究者首先探索L. animalis-EVs能否进入股骨头。研究者采用DiR碘化物标记L. animalis-EVs，将其灌胃至小鼠体内，不同时间点对小鼠的各组织脏器进行离体荧光成像检测。结果显示，3h后小鼠的股骨头呈现大面积的红色荧光信号，表明大量的L. animalis-EVs可以进入股骨头。通过采用针对L. animalis-EVs的特异性抗血清，研究者发现溶剂处理的正常对照小鼠股骨头存在L. animalis-EVs信号，MPS处理组小鼠的股骨头L. animalis-EVs信号明显减少，灌胃L. animalis-EVs可明显增加正常小鼠和MPS处理组小鼠L. animalis-EVs的丰度。上述结果表明L. animalis-EVs在生理条件下即可被运输到宿主股骨头，MPS可导致L. animalis-EVs丰度减低，外源性移植L. animalis-EVs可增加其在宿主股骨头的分布。研究人员进一步发现，在GC处理早期阶段每周一次口服L. animalis-EVs，持续处理6周后，可明显减轻小鼠GC性ONFH表型，包括减轻MPS处理组小鼠股骨头骨微结构破坏，增加血管丰度和成骨细胞数量，减少凋亡细胞数量。

6、L. animalis-EVs和L. animalis的蛋白质组学分析

最后，本研究利用蛋白质组来分析L. animalis-EVs和L. animalis中的蛋白质情况。在L. animalis-EVs和L. animalis中总共鉴定了1136种蛋白质。GO生物过程富集分析结果表明，L. animalis-EVs富含参与中性氨基酸、有机酸跨膜、L-氨基酸等转运的蛋白，以及与核苷二磷酸磷酸化、核苷酸磷酸化或核苷二磷酸代谢过程相关的蛋白质，表明EVs在细胞物质转运及在细胞代谢中的功能作用。KEGG通路富集分析显示，L. animalis-EVs中富含包括NOD样受体信号途径、磷酸转移酶系统、b-内酰胺抗性和三磷酸腺苷结合盒(ABC)转运等信号通路相关蛋白。这些发现表明L. animalis-EVs选择性地富集一系列重要的功能蛋白。
 

    在这项研究中，作者通过巧妙的实验设计及详实可信的结果，首次发现了肠道菌群中的有益菌L. animalis可通过向宿主传递功能性EVs发挥骨保护作用，GC导致的L. animalis及其EVs的减少与ONFH发病相关，为GC性ONFH的防治提供了新思路和新策略。

天昊生物Accu16S^TM细菌与AccuITS^TM真菌绝对定量测序技术简介：

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