Sci Total Environ. | 天昊专利技术Accu16S细菌绝对定量测序在水体沉积物抗生素污染研究中的新进展

原创上海天昊生物

最近，客户利用我们天昊生物专利技术--Accu16S^®细菌绝对定量测序发表的好文章接连不停！今天，小编就再介绍一篇来自北京大学环境科学与工程学院科研人员发表在《Science of the Total Environment》（IF = 10.753）上的论文。该研究利用天昊Accu16S^®细菌绝对定量测序专利技术，深入探讨了抗生素在有无沉积物情况下对水体反硝化作用的影响。

英文题目：Sediments alleviate the inhibition effects of antibiotics on denitrification: Functional gene, microbial community, and antibiotic resistance gene analysis

中文题目：沉积物减缓抗生素对反硝化作用的抑制作用：功能基因、微生物群落和抗生素抗性基因分析

期刊名：Science of the Total Environment

发表时间：2022年

影响因子：10.753

背景简介

农业和城市活动大大增加了向地表水中排放的氮量。河流中的硝酸盐(NO3^--N)污染成为全球日益严重的公共卫生问题。反硝化是通过细菌将NO3^-或NO2^-生化还原为气体N（分子N2或N的氧化物），这是从天然水中去除氮的关键。

随着在人类和动物中的广泛应用，在水生环境中经常检测到一定量的抗生素。除了促进抗生素抗性基因（ARGs）的传播，水生环境中残留的抗生素也会干扰微生物对氮的转化。以往的研究表明，抗生素可以抑制反硝化细菌的生长，改变群落结构和功能基因反硝化细菌的丰度（narG、napA、nirK、nirS、norB和nosZ），并促进NO2^--N的积累。甲砜霉素和磺胺甲恶唑（SMX）促进了NO2^--N和N2O的积累，同时减慢了反硝化速率。

悬浮沉积物普遍存在于天然河流中，在氮循环中发挥着重要作用，尤其是在反硝化过程中。沉积物的存在显着加快了水系统的反硝化速率并增加了水库中细菌的丰度。此外，沉积物可以吸附有机污染物，进而改变有机污染物对反硝化的作用。然而，尽管有大量关于沉积物或抗生素对反硝化作用的研究，但沉积物如何影响抗生素对反硝化和反硝化细菌群落的影响仍不清楚。

因此，本研究选择了SMX、四环素（TC）和氧氟沙星（OFL） 3种抗生素作为目标有机污染物。在没有和有沉积物的情况下，研究了抗生素对NO3^--N反硝化作用的影响。通过Accu16S^®细菌绝对定量测序和qPCR分析反硝化微生物群落结构和功能基因，揭示抗生素和沉积物对反硝化作用的影响机制。此外，进行了ARGs的高通量分析以研究ARGs的变化并揭示它们与在各种抗生素的压力下NO3^--N反硝化的关系。这项研究为抗生素对反硝化作用的影响提供了新的视角，并强化了沉积物对抗生素污染的天然水体中NO3^--N去除的重要性。

研究方法

沉积物样品在长江监测点采集。通过总有机碳（TOC）分析仪测量沉积物的总有机碳。使用电感耦合等离子体发射光谱法、质谱法和原子荧光光谱法对沉积物中的金属浓度进行定量。

之后还在不同浓度抗生素及有无沉积物情况下，进行了硝酸盐还原实验和qPCR检测了反硝化功能基因定量实验。

反硝化细菌的绝对定量 16S-seq (AQS) 在采用Accu16S^®细菌绝对定量测序进行的（V3-V4 区）。

此外，研究还使用SmartChip平台，基于高通量定量PCR(HT-qPCR)评估反硝化细菌中ARG和移动遗传元件(MGE)的多样性和丰度。共涉及 212 个引物组合，包括198个ARGs、8个转座酶基因、5个整合子基因和1个16S rRNA基因。

研究结果

抗生素对有沉积物和无沉积物反硝化的影响

如图1 a-c所示，NO3^--N还原过程可分为两个阶段：慢适应阶段（0-6 h）和快速反应阶段（6-12 h）。相应地，细菌的生物量在适应期保持恒定，然后在快速反应期迅速增长。高浓度的抗生素（1和10 mg/L）显着抑制NO3^--N的减少。此外，抗生素对NO3^--N还原的抑制作用顺序为OFL > TC > SMX。

实验选择10 g/L的沉积物来研究有沉积物时抗生素对反硝化作用的影响。与没有沉积物的反硝化曲线（图1a-c）相比，沉积物的存在显着减缓了SMX、TC和OFL的抑制作用（图2a-c）。

此外，与以往的研究一样，观察到NO2^--N的积累，NO2^--N的峰值出现对应于快速去除NO3^--N (图1d-f)。此外，与不存在抗生素的情况相比，发现在存在抗生素的情况下NO2^--N的浓度仅略有增加。在没有沉积物的情况下，100 μg/L SMX和TC增加了NO2^--N的积累。与NO3^--N还原相比，NO2^--N还原对抗生素更敏感。在沉积物存在下，SMX、TC和OFL在10和100 μg/L时NO2^--N的还原加速（图2 d-f）。

图1、在没有沉积物的情况下，抗生素（10 μg/L–10 mg/L）对反硝化的影响。

图2、存在沉积物(10 g/L)时抗生素 (10 μg/L–10 mg/L)对反硝化的影响。

反硝化功能基因的反应

以往的研究表明，反硝化功能基因（DNG）的丰度与反硝化速率相关，DNGs的相对丰度可以表征反硝化过程。本研究负责反硝化的DNG的丰度如图3所示。无沉积物的W组和有沉积物的S组中膜结合硝酸还原酶基因(narG)的相对丰度高于周质硝酸还原酶基因(napA)（图3a和b）。与对照样品（W-CK）相比，W组中narG的相对丰度下降（图3a），而napA没有发现显着差异（图3b）。这可能表明narG更容易受到抗生素的影响。含铜亚硝酸还原酶基因（nirK)和含有细胞色素cd1的亚硝酸还原酶基因(nirS)参与了NO2^--N向NO的还原，并且nirK的相对丰度高于nirS（图3c 和d）。此外，与对照样品（W-CK）相比，W组nirK的相对丰度降低（图3c），但nirS没有显着差异，表明nirK也容易被抗生素抑制。不同于以往的研究，硝酸还原酶基因(narG和napA)的相对丰度显着高于亚硝酸还原酶基因(nirK和nirS)，这解释了NO2^--N积累的原因。

抗生素的添加显着降低了W组中narG、nirK、nosZ和总DNG的丰度（图3），这进一步强调了抗生素对反硝化的抑制作用。值得注意的是，沉积物的存在显着增加了所有DNG的相对丰度（图3），尤其是napA和nirS的相对丰度（图2）。这解释了沉积物促进NO3^--N和NO2^--N的减少，进而解释了沉积物的存在减轻了抗生素的抑制作用。

图3、不同分组中的反硝化功能基因丰度（W，无沉积物水溶液；S，添加沉积物；抗生素浓度100 μg/L；沉积物浓度10 g/L；不同字母表示差异显着）。

细菌群落的变化

实验利用Accu16S^®细菌绝对定量测序专利技术，评估了抗生素和沉积物对微生物多样性的影响。虽然W组和S组之间的群落丰富度（观察的物种，Chao1，ACE）和多样性（Shannon，Simpson）没有显着差异。然而，通过Bray-Curtis距离对细菌群落的PCoA分析发现W组与S组分离，表明它们在细菌群落中存在差异（补充材料）。

抗生素的添加将细菌丰度从1.8×10⁵ copies/ng DNA降低到1.4×10⁵ – 1.7×10⁵ copies/ng DNA（图4a）。相反，沉积物的添加则显著增加了反硝化细菌的丰度（图4a），表明沉积物中的微位点和底物有利于细菌附着在沉积物表面，导致反硝化细菌数量增加。此外，在 S 组中，抗生素并没有显着抑制细菌的生长。结果表明，沉积物通过促进细菌的生长减轻了SMX、TC和OFL的抑制作用（图2 a-c）。

在属水平上，Acinetobacter在所有样品中占优势（1.0×10⁵ – 1.84×10⁵copies/ng DNA），占总丰度的64.7-82.0%，其次是Enterobacter（1.66-8.69%）、Bacillus（1.73-7.17%）、Klebsiella（1.95-4.54%）和Lysinibacillus（0.60-2.45%）（图4b）。与总微生物群落类似，抗生素的添加降低了W组中Acinetobacter的丰度，表明Acinetobacter也受到抗生素的影响。同样，沉积物的添加增加了不动杆菌的丰度（补充材料）。

利用PICRUSt2对群落功能进行预测，共发现有30条2级代谢途径和144条3级代谢途径，它们属于6个KEGG 1级代谢途径（图4c）。代谢相关的KEGG途径占主要部分。辅因子和维生素的代谢（14.4-15.0%）、氨基酸代谢（13.9-14.3%）和碳水化合物代谢（12.0-12.8%）是二级代谢的三个最主要途径。

图4、不同暴露组中门(a)和属(b)水平的微生物群落组成；(c)PICRUSt2预测的微生物群落代谢途径。

ARGs和MGEs的变化

为了探索反硝化细菌对各种抗生素的耐药性，基于HT-qPCR共检测到181个ARGs亚型和10个移动遗传元件（MGEs）（图5 a-e）。检测到的耐药基因主要为多药、β-内酰胺酶、四环素、磺胺、MLSB、氯霉素。向日葵图显示所有样本共有37个基因（图5a）。S组（57）比W组（48）有更多的ARG（图5）。结果可能表明沉积物的添加改变了细菌群落，尤其是携带ARG的细菌群落。

ARGs 的相对丰度可以揭示携带 ARG 的细菌的百分比（Chen et al., 2019a）。在此，抗生素的添加显着降低了W组和S组中ARGs的相对丰度（图5 f）。此外，W组中ARG的相对丰度降低可能归因于细菌丰度的降低（图4a）。另一方面，沉积物的存在也降低了ARGs的相对丰度（图5 f)。这可能归因于抗生素在沉积物上的吸附，减缓了抗生素的选择压力，从而促进了不含 ARGs的细菌的生长。

图5、（ac）向日葵图和维恩图（花瓣中的数字表示ARGs的数量），（d和e）网络分析，以及（f和）不同抗生素（100 μg/L）处理沉积物有无的样品中ARGs的相对丰度。

PLS-PM分析和网络分析

PLS-PM分析表明抗生素对细菌、MGEs、ARGs和DNGs有负面影响（图6a），这表明抗生素可以抑制细菌的生长并降低DNG的丰度。这解释了抗生素对反硝化的抑制作用。沉积物对细菌和DNGs有显着的正向影响，进一步证实了沉积物的添加促进了细菌的生长，增加了DNGs的丰度，从而加速了反硝化。然而，沉积物对MGEs和ARGs有负面影响，这可能是由于沉积物促进了不含ARGs的细菌的生长，因为添加沉积物通过吸附减缓了抗生素的选择压力。沉积物和细菌对DNGs有直接的积极影响，而MGEs、抗生素和ARGs对DNGs有直接的负面影响。

Spearman相关分析显示MGEs和ARGs之间存在密切的正相关关系（r = 0.88，p< 0.01），这与PLS-PM（0.173）的结果一致，即MGEs对ARGs显示出积极的影响（图2）。网络分析（图6b）表明，编码转座酶的tnpA-01、Tp614和tnpA-05是模块2和模块4的“枢纽”基因，表明细菌与ARGs的持续和繁殖密切相关。图6b进一步证明了Bacillus、Acinetobacter和Enterobacter与模块1中的ARGs和DNGs密切相关。

图6、(a)PLS-PM反映了抗生素、沉积物、细菌、MGEs、ARGs和DNGs之间的关系和(b)网络分析揭示ARGs、MGEs、DNGs和细菌之间的相关性（节点根据模块类型着色。节点的形状和大小分别表示元素的类型和连接元素的数量。连接表示与 Spearman相关系数存在p≥0.7或p≤-0.7的强相关性。

研究结论

本研究检测了三种常用抗生素在有无沉积物的情况下对反硝化作用的影响，并通过对微生物群落结构、DNGs和ARGs丰度的分析揭示了其作用机制。这项研究强调了抗生素对反硝化作用的影响不容忽视，因为它们广泛存在于水生环境中。此外，本研究揭示了沉积物在减缓抗生素对反硝化作用的影响中的关键作用，并揭示了抗生素和沉积物如何影响反硝化作用的机制。这些结果为评估天然水中抗生素的潜在风险提供了新的见解。

天昊生物

Accu16S^®细菌与AccuITS^TM真菌绝对定量测序

专利技术简介

天昊生物一直秉承“自主研发、创新驱动”的发展理念，在微生物多样性检测领域潜心研发多年，率先于2019年和2021年在国内市场成功推出了Accu16S^®细菌和AccuITS^TM真菌绝对定量测序技术服务，并顺利申请了国家技术专利。我们的微生物绝对定量技术完美的解决了国内同类相对定量扩增子测序服务“只测比例，不知数量”的技术痛点，一个样本单次检测，即可同时获得样本微生物多样性的“相对比例”和“绝对数量”，让样本总菌和特定菌种的绝对数量结果唾手可得。