新突破！天昊扩增子绝对定量测序助力客户定向敲除细菌研究喜登Cell子刊《Cell Reports Methods》

在细胞生物学中，基因过表达和敲除/敲降技术通常成对用于研究选定的基因。在肠道菌群研究中，细菌植入和悉生动物模型常用于对感兴趣细菌的研究。然而，在肠道菌群研究中，仍然没有敲除/敲降细菌的标准方案。

肠道微生物组对人类健康至关重要。小鼠微生物群模型，包括悉生小鼠，是阐明肠道细菌功能的最有用工具。在这里，文章提出了一种靶向细菌敲除（TBD）模型，使用裂解噬菌体选择性地敲除健康或其他模型小鼠的肠道细菌。这些噬菌体处理的动物除了敲除的细菌，应该具有几乎完整的肠道细菌谱。为了证明这一概念，研究者采用大肠杆菌特异性噬菌体T7来抑制健康小鼠中的大肠杆菌。实验结果表明，敲除大肠杆菌的小鼠表现出类似勇敢的行为，并且与大肠杆菌的存在相关，而不是肠道细菌之间的平衡。因此，研究者证明TBD模型是一种阐明近乎完整肠道菌群环境中特定细菌物种功能的有力工具。

肠道是人体中最大的微生物群库，存在着一系列细菌、真核生物和病毒。肠道细菌的多样性和相互作用极大地影响宿主的新陈代谢，与人类健康的诸多方面息息相关。例如，肠道菌群可以调控宿主免疫反应，微生物群组成的改变能够影响一系列疾病的发生发展此外。药物作用通常会对肠道菌群产生影响，会对如用于治疗精神分裂症等心理健康状况的疗法产生了深远影响。

微生物群-肠-脑轴（MGB）是微生物群-宿主相互作用的典型例子。MGB从肠脑轴（GBA）扩展而来，它描述了大脑和肠道神经系统之间的双向通信，描述了肠道菌群与中枢神经系统之间的关系。例如，肠道微生物可以产生神经活性分子，通过迷走神经在肠道神经系统和大脑之间发出信号。在胁迫条件下，微生物群的组成也可以通过下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）通过肠上皮细胞进行调节。一些肠道细菌的丰度与心理健康状况相关，称为心理生物组（psychobiome）。例如，肠道中的Streptococcus vestibularis可以诱导精神分裂症样行为，抑郁症患者的Coprococcus和Dialister水平通常降低。

大肠杆菌占肠道菌群的0.1%-5%，是一种特征明确的模式生物，可用于研究MGB。虽然它产生对哺乳动物宿主功能至关重要的维生素K和B12，但它也可能诱发患者的精神症状。此外，具有诱导焦虑样行为的小鼠肠道大肠杆菌水平升高。研究者目前对MGB的大部分理解都是使用具有抗菌处理的人造动物模型确定的，包括无菌小鼠和无特异性病原体（SPF）小鼠。这些动物模型有其自身的优势：抗生素处理的小鼠模型易于研究，但无法评估单个细菌菌株的影响。虽然使用接种了选定微生物无菌小鼠的悉生小鼠模型是研究特定菌株的金标准，但其生理影响在自然环境中可能不具有代表性。此外，使用悉生生物模型的研究既耗时又昂贵。

在这里，研究者提出了一种新的动物模型，该模型结合了悉生小鼠模型在细菌菌株精度方面的优点，以及仅使用普通小鼠即可建立的便利性。通过使用裂解噬菌体，可以在动物模型中靶向敲除特定的肠道细菌。为了证明这一假设的可行性，研究者选择使用大肠杆菌特异性噬菌体T7从健康小鼠的肠道中去除大肠杆菌，并通过分子和表型分析来检测其影响(图1)。令人惊讶的是，这些靶向敲除大肠杆菌（TBD）小鼠表现出类似于先前发表的抗焦虑和抗抑郁治疗效果的行为变化。与对照组相比，这些原本健康的动物获得了“勇敢”的个性，没有过度活跃。因此，本研究表明TBD小鼠模型提供了一种与传统悉生模型互补的方法来验证实验数据，并且可以通过选择不同噬菌体来研究各种肠道细菌。

本研究使用健康的6周龄雌性C57BL/6J小鼠，用大肠杆菌噬菌体T7与大肠杆菌（菌株K12）进行处理。在噬菌体处理后第0、1、2、4、6、8、10、12和14天收集粪便样品。本研究行为测试包括：旷场实验、互惠社交互动测试、三箱社交测试、高架十字迷宫试验、新物体识别测试、新颖性抑制饲养试验和悬尾实验。行为实验后，每组随机3只小鼠，对肠道等器官进行组织学分析。

本研究使用天昊生物Accu16S^®绝对定量测序技术，对小鼠肠道细菌的绝对丰度和多样性进行分析。此外也使用了qPCR实验对小鼠粪便中的细菌和大肠杆菌，以及T7噬菌体总量进行检测。

研究者使用qPCR来量化大肠杆菌和总肠道细菌的数量，以跟踪噬菌体给药后的动态变化。在14天的过程中，所有组中的肠道细菌总体种群没有显示出明显的扰动。相比之下，T7^H组与对照组相比，大肠杆菌迅速降低至∼10%，并在第14天逐渐恢复至∼25%，可能是由于其对噬菌体的获得性抗性。此外，T7^L组大肠杆菌的下降在第6天后开始，并在第8天时达到与T7^H相同比例（图2C）。

为了研究大肠杆菌减少的级联效应，研究者使用天昊生物Accu16S^®绝对定量测序技术，通过对16S rRNA基因扩增子（V3-V4区）进行测序来获得微生物分类单元的绝对丰度，以评估肠道菌群的动态变化。实验在4个时间点（即0天和T7噬菌体处理后4、8和14天）研究了粪便微生物群组成。结果发现Chao1指数存在显著性差异，但香农和辛普森多样性指数没有显著影响。相对于对照小鼠，大肠杆菌敲除小鼠的肠道中细菌丰富度降低（图3）。时间和T7噬菌体对微生物组成的β多样性均有显著影响（图3D）。随着T7噬菌体处理，敲除大肠杆菌小鼠肠道菌群β多样性逐渐降低，其β多样性在第8天升高，但在第14天下降。在噬菌体灌胃后第4天和第14天，大肠杆菌敲除小鼠中25和31个肠道细菌属的绝对丰度与对照小鼠存在差异。此外，24个肠道细菌属的丰度表现出明显的纵向变化，而两组之间微生物群的纵向改变模式不同（图3E）。

图3、利用天昊16S扩增子绝对定量测序技术，检测对照组和T7^H组第0、4、8和14天大肠杆菌敲除引起肠道菌群的动态变化。（A-C）肠道菌群α多样性指数（香农、辛普森和Chao1）。（D）基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）。（E）受T7噬菌体调控并随时间显著变化的24个细菌属的丰度变化热图：左为对照组，右为T7组。

在解剖学上，各组小鼠小肠和大肠上皮表现出反应性增生，保留了正常的腺体结构和核极性（图4F），细胞显示出核质比轻度增加，细胞核略微增大，核深染和有丝分裂率增加，而不存在明显的多形性和非典型有丝分裂。此外，其他主要器官没有观察到异常，即脑、心、肺、肝、脾和肾的病理形态在所有组间没有差异，这表明宿主的生理健康不太可能与行为改变有关。

图4、大肠杆菌敲除小鼠表现出抗焦虑药处理的行为模式。（A）旷场实验。（B）高架十字迷宫试验。（C）新颖性抑制饲养测试。（D）悬尾实验。（E）三箱社交测试。（F）各组小肠和大肠上皮细胞病理形态表现为反应性增生，各组间保持正常腺体结构和核极性。

大肠杆菌在第14天逐渐恢复到T7前水平的25%，进一步确定噬菌体干预后细菌是否可以完全恢复正常非常重要（图2C）。研究者使用qPCR实验对T7^H组和对照组进行粪便大肠杆菌水平追踪实验。第16天的大肠杆菌水平约为对照组的30%，与上一次实验中第14天观察到的水平相似（图5A）。随着细菌水平继续恢复，在大约第24天恢复到噬菌体处理前的水平。为了确认行为异常是由于大肠杆菌敲除引起的，研究者还通过将大肠杆菌灌胃到T7处理的小鼠进行了挽救实验（图5B）。研究者在第0天（基线）、第4天（T7^H管饲后）和第8天（大肠杆菌管饲后）使用TST评估小鼠行为。qPCR结果显示，在14天的实验中，由于口服强饲噬菌体和大肠杆菌，大肠杆菌水平出现波动（图5B）。TST结果在T7^H处理和大肠杆菌挽救实验后，反映符合粪便大肠杆菌的水平（图5C）。值得注意的是，第8天的结果表明，小鼠在重新引入大肠杆菌后恢复正常。

图5、大肠杆菌自我恢复与挽救实验。（A）T7处理组肠道大肠杆菌水平在14天实验后逐渐恢复（数据从第16天开始），并在第24天恢复到噬菌体处理前水平。（B）T7处理组与对照组在14天挽救实验期间的肠道大肠杆菌比例水平，在第4天施用噬菌体，在第8天给予大肠杆菌管饲（n = 12）。（C）第0，4和8天的TST结果显示小鼠的行为变化与大肠杆菌的敲除和重新引入之间的相关性。

该研究获得国家科技部重点专项、国家自然科学基金、陕西省重点研发计划的资助，并获得了西安交通大学第一附属医院生物样本信息资源中心和脑科学研究中心的大力支持。西安交通大学博士生李琰清，西安交通大学第一附属医院朱峰教授、李燕教授文章共同第一作者，刘冰教授、马现仓教授、王亚文教授为文章共同通讯作者。

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盘点 | 天昊生物专利技术--Accu16S细菌与AccuITS真菌绝对定量测序客户文章汇总（医学篇）；

盘点 | 天昊生物专利技术--Accu16S细菌和AccuITS菌绝对定量测序客户文章汇总（环境农学篇）；

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天昊生物绝对定量测序技术，通过向样品DNA中添加一定量人工合成Spike-in内参标准品序列，进行扩增子文库构建及二代高通量测序，再根据内参标准品测序序列数及绝对拷贝数绘制标准曲线，最终计算出样本中OTU/ASV序列对应微生物菌群的绝对拷贝数。

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