原创 上海天昊生物
miRNAs在急性髓系白血病（AML）的发病和进展中发挥着重要作用。miR-182在不同的癌症中作为肿瘤miRNA或肿瘤抑制miRNA发挥作用。然而，miR-182是否影响白血病干细胞（LSCs）和正常造血干/祖细胞（HSPCs）的自我更新尚不清楚。2023年元旦，治疗诊断学杂志—Theranostics（IF：11.6，一区）在线发表了温州医科大学附属第一医院医学研究中心高申孟、何晓飞课题组联合血液内科叶海格课题组最新研究论文“DNA高甲基化诱导miR-182沉默，上调靶基因BCL2和HOXA9，促进白血病干细胞自我更新，从而加速AML进展，并确定BCL2抑制剂维奈托克的敏感性”。该研究从表观遗传学角度揭示了AML发生和发展新机制，并初步明确了miR-182启动子甲基化水平可以确定维奈托克治疗的敏感性，为其提供了潜在的预测性生物标志物。
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值得一提的是，天昊生物有幸参与了本研究中的部分研究工作，我们的目的区域甲基化测序技术Methyltarget®为验证miR-182启动子甲基化水平提供了重要支持。
1.目标发现：miR-182在AML中低表达并与较差预后相关为了研究miR-182在AML原始细胞（blasts）中的表达，作者首先检测了96例未经治疗的AML原始细胞和21个健康志愿者的骨髓（BM）单个核细胞中miR-182的水平。与对照相比，AML患者中miR-182的平均表达显著降低（图1A）。此外，miR-182的表达是亚型依赖的，在t（8;21）和t（11q23）异常核型的AML患者中比对照显著更低，但t（15;17）和inv（16）中无显著差异（图1B）。然而，在t（8;21）、t（11q23）、t（15;17）和inv（16）之间，miR-182的表达没有发现显著差异（图1C）。此外，与对照相比，miR-182在FAB亚型M1、M2、M4和M5中的表达较低，但在M3中没有（图1D）。此外，miR-182在M1、M2、M3、M4和M5之间的表达无显著差异（图1E）。
图1A-E AML原始细胞中miR-182表达水平更低
为了进一步分析miR-182在不同白血病细胞亚群中的表达，从7个AML样本中分离出BM CD34+细胞作为白血病起始细胞和CD34-分化细胞。有6个样本（85.7%）CD34+细胞中miR-182的表达低于CD34-细胞（图1F）。然后，作者探讨了miR-182表达是否与成人AML队列的临床结果相关。miR-182水平较高（高于中位数）的AML患者与更好的5年总生存率 （图1G）和5年无病生存期（图1H）相关。一致地，miR-182水平较高的AML患者在BM（图1I）和外周血（图1J）中均显示原始细胞百分比下降，提示miR-182高表达、低母细胞百分比和总生存时间延长之间存在相关性。
图1F-J miR-182表达水平的临床相关性
2.功能获得：miR-182作为肿瘤抑制miRNA
研究团队选用两种混合谱系白血病（MLL）重排的白血病细胞系（MOLM-13和THP-1），分别利用细胞增殖、集落形成、细胞凋亡和细胞周期等实验证实miR-182过表达抑制了细胞增殖（图2A和B），减少集落形成数量（图2C），诱导凋亡（图2D），阻止细胞周期在G0/G1期（图2E和F）。利用MLL-AF9诱导的白血病小鼠模型，证明移植miR-182过表达细胞的小鼠白血病负荷减少(图2G），生存期延长(图2H）。
图2 过表达miR-182抑制白血病细胞增殖
3.功能缺失：miR-182缺失加速AML进展
作者进一步利用miR-182敲除小鼠，通过构建MLL-AF9诱导的AML小鼠模型，详细研究miR-182敲除在白血病发展中的作用，结果证实了miR-182的缺失显著增强了白血病细胞在脾脏和肝脏的浸润（图3A），并增加白血病细胞的增殖（图3B），缩短小鼠生存期（图3C）。另外，研究也发现miR-182的缺失大幅增强了白血病干细胞（LSC）比值和自我更新能力（图3D）,提示miR-182和白血病自我更新和干性相关。
图3 miR-182缺失增强AML细胞干性
4.机制揭示：RNA-seq发现miR-182敲除加速肿瘤形成信号
为了研究在miR-182缺失的小鼠AML原始细胞中控制LSC增殖和自我更新的潜在机制，利用RNA-seq经通路富集分析发现miR-182敲除AML细胞中包括癌症转录异常和造血细胞谱系在内的信号通路富集（图4A-C）。癌症转录异常通路中的多个富集基因（Hoxa6、Hoxa10和Meis1）与LSC的自我更新和生存相关（图4D和E）。因此，RNA-seq的结果与表型一致，即miR-182的缺失通过增加LSC的自我更新来加速AML的进展。
图4 miR-182缺失促进肿瘤形成信号通路
5.miR-182靶点：miR-182通过直接靶向BCL2和HOXA9发挥肿瘤抑制作用
为了进一步选择miR-182靶基因，通过TargetScan预测可能的靶基因，最终选择与增殖和存活相关的BCL2和HOXA9进行后续试验（图5A和B）。通过荧光素酶报告基因和蛋白实验等证实了miR-182主要影响BCL2和HOXA9的转录后加工或翻译（图5C-E）。
图5 miR-182直接靶向BCL2和HOXA9
6.miR-182表达机制：启动子甲基化抑制miR-182表达
由于CpG岛甲基化诱导的肿瘤抑制基因转录沉默经常发生在癌细胞中，研究进而探索了pri-miR-182启动子上可能的CpG岛，共发现3个位于pri-miR-182上游6-12 kb的CpG岛（CpG岛1-3）。为了确定白血病原始细胞中是否存在DNA高甲基化，团队使用天昊生物MethylTarget®方法检测了8个AML细胞系、34个未处理的原发性AML原始细胞和26个正常BM单个核细胞的甲基化状态。发现CpG岛1和CpG岛3在AML细胞系和原发性AML细胞中的平均频率分别高于对照细胞（图6A、C）；而CpG岛2在原发性AML细胞中的平均频率与对照细胞相似（图6B）。此外，AML患者原代细胞中CpG岛3和CpG岛1的高甲基化程度分别高于CpG岛2（图6D）。
图6 miR-182启动子甲基化水平
正如预期的那样，miR-182在甲基化AML患者（甲基化% > 20%）中比未甲基化患者表达较低。这些结果表明，在白血病细胞中，CpG岛3和1比对照细胞呈现高甲基化，而CpG岛2非高甲基化，miR-182的表达可能受到启动子甲基化的抑制。接下来，作者通过去甲基化药物AZA处理发现AZA显著增加了miR-182表达，进而抑制了靶基因蛋白水平。细胞实验也证实了AZA诱导了白血病细胞的凋亡，并且在AML细胞miR-182启动子高甲基化组中呈现了更好的抗白血病能力。7.甲基化与治疗：miR-182启动子甲基化决定BCL2抑制剂的敏感性
多项研究表明，BCL2表达与维奈托克（Ven）治疗敏感性密切相关，BCL2表达缺失导致Ven耐药。作者首先分析了在miR-182启动子甲基化或非甲基化的AML患者中BCL2的蛋白表达，发现miR-182启动子高甲基化的AML患者BCL2蛋白表达显著升高（图7A）。此外，还检测了Ven的体外敏感性，结果显示，miR-182启动子未甲基化的AML患者对Ven治疗的耐药性明显高于miR-182高甲基化的患者（图7B），这表明miR-182启动子甲基化可能决定BCL2蛋白的表达和Ven治疗的敏感性。
图7 miR-182启动子甲基化决定Ven的敏感性
miR-182在AML细胞中呈现肿瘤抑制功能，通过靶向BCL2和HOXA9抑制LSC自我更新和干性，而不影响正常HSPC增殖和自我更新，表明miR-182是LSC潜在的治疗靶点。miR-182的表达被启动子甲基化抑制或沉默，进而决定Ven的敏感性，该研究为AML中Ven治疗提供预测性生物标志物。
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