西北大学生命科学学院中国西部资源生物与生物技术重点实验室李忠虎教授课题组近期在《Applications in Plant Sciences》上发表了中国特有针叶树华山松的微卫星标记特征解析的研究成果。在这项研究中天昊生物有幸承担了样品的基因组测序工作。在恭喜客户又发表文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文题目：Characterization of Polymorphic Microsatellite Markers in Pinus armandii(Pinaceae), an Endemic Conifer Species to China
中文题目：中国特有针叶树华山松的微卫星标记特征解析
研究背景:
        华山松是一种常绿针叶树种，是中国中部和西南部特有的树种，以往对华山松的研究主要集中在其生理生态学，近年来，由于乱砍滥伐和自然栖息地破坏，华山松自然种群已显著降低，因此了解其种群遗传结构与遗传多样性对制定有效的保护和管理措施是十分必要的。在这项研究中，我们对华山松及其近源物种的SSR多态性进行了阐述从而有助于它们下一步的群体遗传学研究。
研究结果：
   1.  从新鲜针叶中提取基因组DNA，使用Illumina MiSeq PE300，得到6,783,777个clean reads，使用CLC Genomics Workbench version 7.5组装得到350,628个contigs，使用SciRoKo version 3.1提取了含有SSR的contigs，从这些contigs中找到887个SSR候选位点，然后针对这些候选SSR位点设计引物，设计引物的标准是：（1）大小在100-350bp；（2）引物大小18-25 bp，最佳大小为20 bp；（3）引物熔解温度从55°C-63°C，最佳熔解温度为60°C；（4）GC含量为40%-60%。

   2.  随机挑选50对SSR引物在3个华山松自然群体的52个个体中测试其扩增效率和多态性。使用GenAlEx version 6.501来评价微卫星位点的各种群体遗传参数，包括每个位点的等位基因数，预期和观测到的杂合度（He和Ho）和Hardy-Weinberg(HWE)，使用GENE-POP version 4.2.2来计算LD值， 并且使用MICRO-CHECKER version 2.2.3计算了无效等位基因频率。
   3.  50对SSR引物中共有34对引物成功扩增出PCR产物，其中18个位点表现出多态性（表1）。这些多态性引物的等位基因数范围是2-5，平均2.4。


   4.  预期杂合度（He）范围是0.061～0.609，平均0.384；观测到的杂合度（Ho）范围是0.063-0.947，平均0.436（表2）。两对引物（pa3553和pa118137）HWE被发现大大偏离。这种偏差可能是样本量不足，个体之间的非随机交配，迁移，或自然选择这两个位点造成的。

   5.  为了使开发的这些SSR位点得到更广泛的应用，本文检测了这18对引物在其它5种与华山松较同源的松树中（红松、乔松、西伯利亚红松、偃松、白皮松）的效果。结果发现这18对引物中有17对引物能在这5种松树中扩增出明显条带，而引物pa3553在偃松和白皮松中则不能扩增出条带（表3）。

亮点：
        本文利用华山松基因组测序数据采用de novo的方法拼接了一部分基因组contig，结果发现了887候选SSR多态位点，再对其中一些候选SSR位点扩大样本验证其多态性，结果发现18个SSR位点在华山松中确实具有多态性，然后在其它5种松树发现17种SSR位点也具有多态性，从而找到了适合松树遗传多样性研究的SSR位点。实际上华山松基因组测序数据除了挖掘基因组上的SSR位点，还可以将测序数据和参考基因组（近源物种）序列进行比对，去除核基因组序列 ，对其叶绿体基因组进行组装拼接，从而得到其细胞器基因组序列。