中国科学院地理与湖泊研究所史小丽课题组，近期在《Fundamental and Applied Limnology》上发表了CO₂改变淡水生态系统中微微型浮游植物群落结构的文章。在这项研究中天昊生物有幸承担了样品的扩增子测序工作和生物信息学分析。在恭喜客户又发表文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文题目：CO₂ alters picophytoplankton community structure in fresh water ecosystems
中文题目：CO₂改变淡水生态系统中微微型浮游植物群落结构
期刊名：Fundamental and Applied Limnology      发表时间： 2016年11月
研究背景: 大气CO₂浓度从工业化前的280 ppm增加到现在的400 ppm，预计到下一世纪将翻一番，达到750 ppm。最近研究指出，60%富营养化湖泊的CO₂是不饱和的，富营养和碳限制在淡水系统是很常见的。由于地球上的大多数湖泊很浅且易受水运动影响，这就决定了空气和水之间CO₂的流动。因此，大气CO₂浓度增加可能对这些富营养化的淡水生态系统有重要影响。微微型浮游植物（小于3µm）包括picocyanobacteria和photosynthetic picoeukaryotes(PPEs)，它们分布广泛，并且在许多湖泊和海洋碳循环过程中发挥关键作用，它们分别在淡水和海洋系统中可以占到总?碳?生产的16% - 70%和1?%- 90 %。?但是目前关于这些微微型浮游植物对CO₂变化的响应以及这些响应对整个生态系统的作用仍然是未知的。
研究目的:调查 CO₂浓度升高如何改变微微型浮游植物的群落结构以及具体哪个微微型浮游植物物种对CO₂浓度升高是敏感的
 
技术：18S rRNA扩增子测序，V4区
测序平台：Illumina MiSeq测序平台
实验设计：
         实验在东湖太湖生态?站?进行。湖水通过100µ米孔径的尼龙筛去除大浮游动物和碎片，然后被泵入九个白色塑料容器中（200升）。容器放置在东湖生态站的人工池塘中来模拟当地的温度和光照水平。每天向容器中补充定量的溶解性营养（KH₂PO₄，NH₄Cl，NaNO₃），使之保持在一个稳定的水平，以避免营养的影响，从而集中观测CO₂处理的影响。分别进行三种不同CO₂水平的处理：270 ppm，380 ppm和750 ppm，从而分别模仿工业化前，当前和未来（2100年）的CO₂浓度。每个处理有3个生物学重复。使用相同的实验系统进行了四次独立观测：分别在2013年8月（夏季），2013年11月（秋季），2014年1月（冬季），2014年4月（春季），从而比较在这4个不同季节微微型浮游植物对CO₂变化的响应。
理化参数：
         每天使用水质分析仪测定硝态氮（NO₃^?–），铵（NH₄⁺）和磷酸盐（PO₄^3?–）浓度。每天补充各养分以确保容器和湖之间的营养水平一致，现场使用多参数测量仪测定水温，溶解氧（DO），pH值和电导率。每3天水样品在上午8:00-10:00运到岸边实验室被立即预处理，被过滤得到的水次级样品立即用来测定叶绿素a（Chl-a）和碱度（ALK）。水中的pCO2根据pH值和碱度（ALK）进行估计。
叶绿素a含量分析：
        通过荧光分光光度法测定叶绿素a含量来估计浮游植物生物量。每个容器100?–?200?毫升水次级样本通过3µm Millipore滤膜过滤两次，然后再经过0.2µM Millipore滤膜过滤。分别对通过3µm和0.2µM膜过滤得到的大型浮游植物和微微型浮游植物进行叶绿素a含量测量。
DNA提取和18S rRNA扩增子测序：
        使用DNeasy Blood and Tissue Extraction Kit (Qiagen)提取hotosynthetic picoeukaryotes (PPEs)DNA。使用真核生物V4区进行18S rRNA扩增子测序。
研究结果：
化学环境
        实验容器中的可溶性营养物质浓度与附近的湖是相似的。硝态氮是主要的溶解态氮组分。铵浓度最高是在春天，达到0.12毫克/升（表1）。磷酸盐浓度在0.075毫克/升-0.17毫克/升变化（表1）。
        不同水平CO2处理引起实验容器中水溶解CO₂浓度的变化，低浓度CO₂处理导致水溶解CO₂浓度也相对较低（图1a）。pH值的季节性变化也较大，秋季最低为6.7，夏天最高为9.8，水溶解CO₂浓度升高会导致所有季节水pH值下降（秋季除外）。


微微型浮游植物丰度
       微微型浮游植物对浮游植物叶绿素生物总量的贡献在不同季节之间差异很大，夏季最低达到18%，冬季最高为79%，然而不同浓度CO2处理之间微微型浮游植物对浮游植物叶绿素生物总量的贡献却没有差异（表2）。

        通过流式细胞仪对两种微微型浮游植物进行鉴定：一组是Phycocyanin-rich picocyanobacteria，它具有丰富的藻蓝蛋白，是由PC细胞构成；另一组是photosynthetic picoeukaryotes (PPEs)，则含有丰富的叶绿素a（图2）。

        通过流式细胞技术分析发现，在春天，PC细胞经历了爆炸性增长，密度从24×10³个细胞/微升涨至1280×10^3?细胞/微升（图3a）。在夏天，第21天达到顶峰，密度达到1000×10^3?细胞/微升（图3b）。在秋天，PC细胞只有在最后一天才表现出明显的增长（图3c）。在冬天，PC细胞的浓度太低没有被检测到。
        在春季和秋季，PPES浓度在结束阶段表现出持续的增长（图3d，3f）。在夏季的早期阶段，PPES浓度迅速增加，在第6天达到最大值，然后下降（图3e）。总体来说，春季PPEs含量最高，冬季PPEs含量最低（图3g）。在春季试验后期，PPEs的细胞密度在高浓度CO₂处理下显著较高（图3d）,而在冬季，PPEs的细胞密度在高浓度CO₂处理下则显著较低。

PPEs群落组成
         首先通过流式细胞技术将PPEs分选出来，然后通过18SrDNA扩增子测序技术对春季和冬季不同浓度CO₂处理下的PPEs群落结构进行分析。结果发现PPEs的162个OTUs可以归类为Cryptophyta（隐藻门）, Haptophyta（定鞭藻门）, Stramenopiles（不等鞭毛门）, Chlorophyta（绿藻门）等。其中，Chlorophyta（绿藻纲）和Chrysophyceae（金藻纲）占总序列数的比例居多，大约占30%（图4）。春季和冬季PPEs的群落结构主要差异是：Bacillariophyceae（硅藻纲）只在春天可以发现（图4）。

        PPEs的群落组成在春季和冬季非常相似，有100个共有的OTUs，分别有30个OTUs不同（图5）。在春季，3个不同浓度CO₂处理共有78个OTUs，一个金藻纲OTU显示对CO₂浓度变化十分灵敏（表4），其比例随着CO₂浓度上升而减少。在冬季，3个不同浓度CO₂处理共有55个OTUs（图5），一个衣藻属OTU，其比例随着CO₂浓度上升而减少（表4）。2个隐藻门OTU比例随着CO₂浓度上升而减少。2个金藻纲OTU比例随着CO₂浓度上升而上升（表4）。

总结：
      1.   微微型浮游植物占东太湖浮游植物的主要部分，它们的叶绿素a含量最多贡献了冬季叶绿素a总量的79%。
      2.   Phycocyanin-rich picocyanobacteria（PC细胞）占东太湖微微型浮游植物群落的主要部分（冬季除外）。
      3.   PC细胞浓度对CO₂浓度的改变不敏感；与此相反，在春季，CO₂浓度升高能显著增加photosynthetic picoeukaryotes (PPEs)的丰度，但是在冬季则降低了PPEs的丰度。
      4.   使用18SrDNA扩增子测序对春季和冬季不同浓度CO₂处理下PPEs样品进行群落结构分析，结果表明Chlamydomonas（衣藻纲）和Cryptophyceae（隐藻纲）不受高浓度CO₂处理青睐，其比例随着CO₂浓度上升而减少；而Chrysophyceae（金藻纲）则受惠于CO₂浓度增长，其比例随着CO₂浓度上升而增加。
 
关于天昊：
      天昊生物采用Miseq PE250测序策略对细菌16S rDNA区/真菌ITS区/真菌18S rDNA区的双V区或多种单V区进行测序，使用低循环数扩增，保证每个样品扩增的循环数统一；采用特殊方法可有效避免系统内误差；数据质量高，有效序列Q30达到80%以上；加上最新升级的分析内容和解释详尽的结题报告，带您享受极致的微生物扩增子测序体验。