微生物绝对定量or相对定量,你选对了吗

前常规16S扩增子测序在分析样本间微生物组成时仅考虑微生物的相对丰度（比例），然而相对丰度信息不能反映样本中微生物物种真实的绝对丰度情况，从而对样品间菌群的真实变化分析造成严重误判，而且多篇研究文献已经证明只有绝对定量分析才能反映样本每种微生物的真实数量和组间样本的真实差异，因此绝对定量才是微生态研究的首选。我司于去年下半年推出微生物16S扩增子绝对定量测序技术以来，受到医学肠道和环境微生物领域老师同学们的广泛欢迎和好评。今天小编就通过一系列实验数据系统展示一下绝对定量VS相对定量的优势！

Demo实验设计

将9种标准菌株DNA按一定比例混合，标记为标准品DNA。group1：向10ng标准品DNA（微生物DNA占比100%）中添加10ⁿ拷贝外标序列，共3个生物学重复；group2：将标准品DNA与hela细胞基因组DNA按照质量比1:9的比例混合，混合后微生物DNA占比10%，然后向上述10ng DNA（微生物DNA占比100%）中添加和group1相同拷贝数的外标序列，共3个生物学重复。然后用天昊微生物16S扩增子绝对定量测序技术对上述2组样品进行检测，将绝对定量分析（AQ）和相对定量分析（RQ）结果进行对比。

注：上述2组间样本只是在微生物总量相差10倍，组间样本同一个菌/总菌的比例完全相同。

结果展示

Alpha多样性分析

多样性指数分析

结论：demo样本因为是购买的标准菌株混合后的样本，物种组成较单一（共9种），所有样本基于相对定量分析（RQ）和绝对定量分析（AQ）得到的群落Observed species均完全一致（都是9种）， shannon和simpson指数也相似。
注意：现实样本通过相对定量分析（RQ）得到的Observed species个数以及shannon和simpson指数都会比绝对定量分析（AQ）低，原因是抽平使得OTU个数减少，低丰度OTU的数据丢失。

Beta多样性分析

基于Euclidean（考虑物种有无、绝对丰度）的PCA分析：绝对定量分析（AQ）中Group1和Group2两组整体菌群组成差异较大，第一象限的差异解释率达98%，而相对定量分析（RQ）中Group1和Group2两组组成更为相似。
原因分析：这是因为基于Euclidean距离的PCA分析考虑物种组成和物种绝对丰度情况，group1和group2物种组成相同，所以AQ和RQ分析结果的差异主要取决于两种分析得到的物种绝对丰度的差异。

PCoA分析

基于Bray-Curtis（考虑物种有无、绝对丰度）的PCoA分析：绝对定量分析（AQ）中Group1和Group2两组整体菌群组成差异较大，第一象限的差异解释率达99%，而相对定量分析（RQ）中Group1和Group2两组组成更为相似。
原因分析：这是因为基于Bray-Curtis距离的PCoA分析考虑物种组成和物种绝对丰度情况，group1和group2物种组成相同，所以AQ和RQ分析结果的差异主要取决于两种分析得到的物种绝对丰度的差异。

基于Weighted UniFrac（考虑物种有无、遗传距离、相对丰度）的PCoA分析：绝对定量分析（AQ）和相对定量分析（RQ）的结果相似。
原因分析：这是因为基于Weighted UniFrac距离的PCoA分析考虑物种组成和物种相对丰度占比情况，group1和group2物种组成相同，而两种分析得到的物种在样本中的相对丰度比较一致，所以AQ和RQ分析结果相似。

群落组成分析

Barplot分析

结论：绝对定量分析（AQ）和相对定量分析（RQ）得到的群落组成结果差异巨大，而绝对定量分析（AQ）结果完全符合理论预期。
原因分析：AQ是以物种真实的绝对拷贝数为基础，RQ是以抽平的序列数为基础，因为抽平人为将不同样本间的微生物总量调成一致，掩盖了样本间微生物总量的真实差异。

Heatmap分析

结论：绝对定量分析（AQ）和相对定量分析（RQ）得到的热图（横坐标为9种菌，纵坐标为不同组间样本），结果差异巨大，而绝对定量分析（AQ）结果完全符合理论预期。
原因分析：AQ是以物种真实的绝对拷贝数为基础，RQ是以抽平的序列数为基础，因为抽平人为将不同样本间的微生物总量调成一致，掩盖了样本间微生物总量的真实差异。

实验数据总结

上述实验数据结果说明如果样本间微生物总量本身存在差异，使用传统的相对定量分析会造成错误的研究结论，所以，为了得到样本间细菌群落的真实变化结果，微生态的研究必须用绝对定量分析替代传统的相对定量分析。
以上就是天昊16S扩增子绝对定量测序部分更新内容和亮点，当然我们也会继续升级有应用价值的分析内容，感兴趣的小伙伴们可以关注天昊生物微信公众号，小编会不定期更新哦。

客户合作情况

作为国内唯一一家提供 “微生物16S扩增子绝对定量测序”技术的服务商，我们首先感谢客户的信任和选择，仅仅在2018年第四季度，微生物16S扩增子绝对定量测序技术平台已经完成项目数十个，合作的单位包括中国科学院南京土壤研究所、中国科学院水生生物研究所、厦门大学环境与生态学院、中国农业大学、南京农业大学、东北农业大学、重庆市农业科学院、盐城工学院、南京财经大学、南京中医药大学、武汉大学中南医院、新疆医科大学公共卫生学院、山东大学齐鲁医院等多个单位，覆盖环境微生物和肠道微生物等领域。
2019年，我们期待，与您的合作！