一个样本同时检测4种RNAs，全转录组方案快速斩获5分文章

原创上海天昊生物上海天昊生物

DNA is boring, RNA is fascinating！

---by Paul Houle

如果您手中有表型差异、不同发育时期或者各种胁迫处理的样本，但又不知如何下手展开研究，全转录组测序将不失为一种“简单高效”的研究策略。通过全转录组分析，能够同时得到4种RNAs（mRNAs、lncRNAs、miRNAs和circRNAs）表达变化，以及竞争性内源RNA (ceRNA)网络调控关系等大量原始数据，揭示这些过程中的复杂调控网络及分子调控机制，为一篇5分的文章打下坚实的基础。下面我们看一篇典型案例。

题目：Comparative Transcriptome Analysis Reveals New lncRNAs Responding to Salt Stress in Sweet Sorghum

比较转录组分析揭示甜高粱对盐胁迫响应的新lncRNAs

发表期刊：Front. Bioeng. Biotechnol.

发表时间：2020-4-15

影响因子：5.122

研究内容速览：

长链非编码核糖核酸（lncRNAs）可以通过调节功能基因的表达来增强植物的抗逆性。甜高粱是耐盐的能源作物，但是其lncRNAs如何应对盐胁迫的仍鲜为人知。在这项研究中，研究者分别在耐盐的M-81E和盐敏感的Roma甜高粱品种中鉴定出126个和133个差异表达的lncRNAs。盐胁迫在M-81E中诱导了三个新的lncRNAs，并抑制了两个新的lncRNAs，包括lncRNA13472、lncRNA11310、lncRNA2846、lncRNA26929和lncRNA14798，它们可能作为竞争性内源RNAs (ceRNAs)发挥作用，通过调节与离子转运、蛋白质修饰、转录调节以及物质合成和转运相关的靶基因的表达来影响植物对盐胁迫的响应。此外，M-81E拥有比Roma更复杂的ceRNA网络。这项研究为甜高粱耐盐基因和盐胁迫反应复杂调控网络提供了新的信息

研究方法：

分别对经过盐处理和不处理的M-81E和Roma品种进行全转录组测序（构建去除rRNA链特异性文库+小RNA文库），三个生物学重复共计12个样本。之后对部分差异表达变化RNAs进行qPCR验证。

部分实验结果展示：

图1、M-81E和Roma品种盐胁迫和对照样品之间差异表达基因DEGs的鉴定及表征。

图2、差异表达lncRNAs (DELs) 的鉴定和表征。

图3、ceRNA中13个lncRNAs调控靶基因的GO富集分析。

图4、ceRNA调控网络图。

图6、ceRNA调控网络中部分RNAs的qPCR验证。

图7、盐胁迫下M-81E (A)和Roma (B)的ceRNA调控假设模型图。粉色、黄色和蓝色节点分别代表lncRNAs、miRNAs和mRNAs。蓝色线条代表miRNA-靶基因相互作用，粉色线条代表竞争关系。

华丽的分割线

可以说，上面的这篇5分很好的完成了全转录组测序方案的“规定动作”，研究者通过对测序实验报告的描述，以及筛选一些相关差异RNAs进行qPCR验证，即可在短时间内轻松发文。

但是全转录组测序大量数据还有更大的空间可以挖掘。如何通过个性化挖掘，发现关键的调控RNAs，并通过大量功能性实验，进而证明生物相关过程中RNAs间的重要调控机制，才能说真正发现了全转录组测序中最珍贵的宝藏。

说到这就不得不提到2007年发表在Nature Genetics上的一篇经典文献，研究者通过对几种RNAs的功能性实验，用强有力的实验数据阐明了几种RNAs之间的调控关系。虽然时间过去十多年，但是现在看来仍具有很好的借鉴意义。

本文研究人员发现，在植物拟南芥中，一种磷饥饿相关的miRNA--miR-399可以与靶标PHO2 mRNA很好的结合并切割它，从而影响植物根部对磷元素的含量和运输。但是本文却发现另外一种同样是磷饥饿相应的非编码IPS1家族基因，本文主要涉及到了IPS1，也能够与miR-399结合，但因为在miR-399切割位点存在几个碱基不匹配，而无法切割IPS1。过量表达IPS1导致与PHO2结合的miR-399变少，进而造成PHO2表达量增加。结合其他实验，这篇文章最终证明了，IPS1通过与miR-399结合，降低了miR-399对靶标PHO2的负调控机制。这就是一个很好的证明RNAs之间关系的功能实验的范例。