英文题目：Evaluation of six primer pairs targeting the nuclear rRNA operon for characterization of arbuscular mycorrhizal fungal (AMF) communities using 454 pyrosequencing
期刊名：Journal of Microbiological Methods    发表时间：2014       
技术： 扩增子测序
测序平台：Roche 454 GS-FLX Titanium测序平台
材料：
        选择比利时的6个苹果果园（5个商业苹果果园和1个野生苹果果园），每个果园从中随机选择三个苹果树，将根挖出来，收集已知含有丛枝菌根真菌AMF的细根。继菌根真菌的微观验证后，将根切成1–2厘米小块，用无菌蒸馏水冲洗两次，然后使用(MoBio Laboratories Inc.,Solana Beach, CA, USA) UltraClean 植物 DNA 提取试剂盒从0.25 g根部组织中提取DNA用于下一步的扩增子实验。

研究背景:
         菌根是自然界中一种普遍的植物共生现象, 它是土壤中的菌根真菌菌丝与高等植物营养根系形成的一种联合体。丛枝菌根真菌（AMF）（球囊菌门）与80%的陆生植物物种的根形成共生体系，丛枝菌根真菌从植物体内获取必要的碳水化合物及其他营养物质， 而植物也从真菌那里得到所需的营养及水分等，因此AMF在生态系统中发挥着关键作用，因此，量化和了解它们的分布和多样性是非常重要的。所有的丛枝菌根真菌（AMF）属于球囊菌门，它分为四个目（多孢囊霉目、球囊霉目、原囊霉目、类球囊霉目）和10个科，大部分AMF属于多孢囊霉科、无梗囊霉科、巨孢囊霉科、原囊霉科等。
        内转录间隔区ITS已被建议作为真菌的标准条形码，但是这个区域它并不能区分相互之间特别紧密的物种。因此Stockinger等建议一个1500 bp区段作为真菌的标准条形码，这个区段包括一段小亚基（SSU）rRNA基因，整个的ITS区段，和一部分大亚基（LSU）rRNA基因。然而目前小亚基（SSU）rRNA基因是最常用的用于分析丛枝菌根真菌（AMF）群落的区段。目前针对SSU不同区段的引物用于分析AMF群落结构，NS31–AM1引物对是第一对用于分析AMF群落结构的引物，这个引物的缺点是能检测到非AMF物种，并且不能检测到AMF家族Ambisporaceae，Archaeosporaceae 和 Paraglomeraceae的所有物种。AMV4.5NF–AMDGR引物与NS31–AM1引物对相比，能检测到绝大部分球囊菌门物种。AML1–AML2引物在使用silico测序研究球囊菌门时具有较好的特异性和覆盖度。在焦磷酸测序时，用的是NS31–AML2引物。除了SSU区域，LSU区域也被用于分析AMF群落结构，最常用的引物对是FLR3-LSUmBr和Glo454-NDL22。因此，这项研究目标是评价以前常用于AMF研究的六个不同AMF引物（表1，图1）在AMF群落结构分析的能力：（I）获得的高质量序列的数量；（ii）AMF物种的选择性；（III）重复性；（IV）准确解析AMF群落结构的能力。

研究结果：
目标区域评价
        四个具有较高核苷酸多样性的SSU区域被发现，其中最具变化的是引物对AMV4.5NF–AMDGR扩增出的区段（图2A）。而AML1–AML2，NS31–AML2，NS31–AM1扩增出的区段包含不太可变的下游区段。在LSU区域，两个引物对（FLR3–LSUmBr和Glo454–NDL22）同时扩增出具有较高核苷酸多样性水平的片段（图2B）。

引物评价
        为了评估候选引物检测丛枝菌根真菌（AMF）物种的能力，候选引物被用于从球囊菌门序列数据库中筛选与之匹配的序列（图3）。获得最佳（即最低）PrimerProspector分数的是NS31 和NDL22，它们能检测广泛的真菌。而AMDGR和 AML2则针对球囊菌门具有较好的特异性几乎能匹配上所有球囊菌门序列。对于FLR3，AM1，AMV4.5NF，score《1的部分分别占到所有球囊菌门序列的90%，80%和70%。而score在1-2之间的部分主要是由于引物3’端内部或外部5bp区域的不匹配造成的，例如FLR3就是在这个区域与无柄孢子科和球囊霉科不匹配。对于AM1，则是由于在这个区域与Claroideoglomeraceae和巨孢囊霉科不匹配。对于AMV4.5NF，则是由于引物3’末端与Claroideoglomeraceae和巨孢囊霉科不匹配，或者是引物3’端序列与Glomeraceae, Pacisporaceae, Diversisporaceae。对于AML1和Glo454，score》2的部分分别占到所有球囊菌门序列的10% and 25%，这是由于引物3’末端与物种序列不匹配造成的（图3）。LSUmBr1-5引物的得分均很差。

测序得到的序列数和针对AMF物种的选择性
        针对样品Ha1, Ha2和Hu3，使用6对引物得到平均序列数是154,665（表3）。当序列被截断至200-250 bp时，总序列数的36.1%-92.3%能通过质量控制。当序列被截断至400 bp时，只有一小部分的序列能通过质量控制（表3）。

通过检测高质量序列在五种主要真菌门(Ascomycota, Basidiomycota,
        Chytridiomycota, Glomeromycota, Zygomycota)的分布来评估不同引物对球囊菌门（Glomeromycota）的选择性（表4）。总体来说AMV4.5NF–AMDGR、AML1–AML2、 NS31–AML2分别产生69,663、73,369、47,992条200–220bp高质量的球囊菌门序列。 使用引物AML1–AML2得到都是球囊菌门的代表序列，表明此引物具有AMF高特异性。使用引物AMV4.5NF–AMDGR 和NS31–AML2得到了球囊菌门四分之三的的代表序列。AMV4.5NF–AMDGR得到的非特异序列大部分属于擔子菌門 (11.1%)和壶菌门 (4.3%)。NS31–AML2得到的非特异序列大部分属于其它真核生物，如线虫类（表4）。引物NS31–AM1、FLR3–LSUmBr、Glo454–NDL22只得到特别少部分的球囊菌门序列，分别占总序列数的(少于1%)、(3.4%) 、(0.3%)。NS31–AM1得到大部分是子囊菌门，而FLR3–LSUmBr、Glo454–NDL22得到大部分是擔子菌門（分别占86.3%和92.0%）。无论序列是截断至200-250 bp或400bp，得到的高质量序列在五种主要真菌门的分布没有明显差异。
AMF群落组成、重现性和多样性
        因为引物AMV4.5NF–AMDGR、AML1–AML2、 NS31–AML2能得到球囊菌门大部分的代表序列，所以进一步评价了这3对引物在分析AMF群落组成方面的差异，结果发现这三对引物得到的AMF群落组成没有显著差异(图S2)。并且使用同一对引物得到的生物学重复样本之间的AMF群落组成也没有显著性差异，表明这3对引物在分析AMF群落组成方面具有优异的重现性。
使用引物AMV4.5NF–AMDGR、AML1–AML2、 NS31–AML2分别得到AMF 33个，26个，28 个OTUs，这三对引物同时检测到的OTUs有20个（图4）。这三对引物所得到的OTUs数目相互之间没有明显的差异（图5），然而当把引物AMV4.5NF–AMDGR +AML1–AML2或AMV4.5NF–AMDGR +NS31–AML2所得到的OUT叠加时，每个样本得到的OTUs数目就会有显著增加，而AML1–AML2 +NS31–AML2所得到的OUT叠加时，所得到的OTUs数目则没有显著增加。而三对引物叠加时AMV4.5NF–AMDGR+AML1–AML2+NS31–AML2则相对于AMV4.5NF–AMDGR +AML1–AML2或AMV4.5NF–AMDGR +NS31–AML2所得到的OUT则没有显著增加。         使用AMV4.5NF–AMDGR得到的AMF群落均匀度相对于其它单独引物对或者组合引物对显著降低（图5），表明该引物针对某些AMF物种具有扩增偏好性。

       为了评价不同引物针对不同AMF科水平的特异性，进一步评价了使用不同引物得到的不同AMF科水平的相对丰度（表5）。AMF序列大多数属于Claroideoglomeraceae（39.93–44.04%），Gigasporaceae（12.34–12.43%）和Glomeraceae（34.95–47.39%），而ambisporaceae，Diversisporaceae和Paraglomeraceae合计占比不足11%。AMV4.5NF–AMDGR、AMV4.5NF–AMDGR + AML1–AML2、 AMV4.5NF–AMDGR + NS31–AML2能得到更多Glomeraceae序列。使用AMV4.5NF–AMDGR得到较少数目的Ambisporaceae、Diversisporaceae、Paraglomeraceae序列，尤其在鉴别Paraglomeraceae序列丰度方面，这对引物(0.11%)相对其它引物(8.84–10.07%)有明显差距。AML1–AML2 和 NS31–AML2在AMF科水平鉴定方面只有细微差别。AMV4.5NF–AMDGR引物相对于它和其它引物组合鉴定了相对较少数目的Paraglomeraceae序列和较多数目的Glomeraceae序列。

结果总结：

1.这项研究从以下几方面评价了以前常用于AMF研究的六个不同AMF引物在AMF群落结构分析的能力：（I）球囊菌门的覆盖度；（ii）高质量的序列数；（III）AMF物种的选择性；（IV）重复性；(v)准确解析AMF群落结构的能力；
          2.引物对AMV4.5NF–AMDGR、 AML1–AML2、NS31–AML2在检测高质量的球囊菌门序列数目方面（AMF的特异性和覆盖率）是优于其它3对引物的。这些引物与AMF序列只有很少的不匹配，能够始终如一地分析AMF群落结构。
          3.尽管AMV4.5NF–AMDGR能够检测到较多球囊霉科（Glomeraceae）序列，但是同时得到较少数目的两性囊霉科（Ambisporaceae）、多孢囊霉科（Diversisporaceae）、类球囊霉科（Paraglomeraceae）序列。
          4.引物组合AMV4.5NF–AMDGR +AML1–AML2（P1+P2），AMV4.5NF–AMDGR +NS31–AML2（P1+P2）能够检测到AMF绝大部分物种。