南京农业大学食品科学与技术学院近期在《Food & Function》上发表了杏鲍菇多糖（PEP）对粪便微生物组成和免疫应答影响的文章。在恭喜天昊生物客户发表微生物文章同时，想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文题目： In vivo fermentation of a Pleurotus eryngii polysaccharide and its effects on fecal microbiota composition and immune response
中文题目：杏鲍菇多糖（PEP）对粪便微生物组成和免疫应答影响
期刊名：Food & Function       影响因子： 3.2469
材料方法:
实验设计
        所有老鼠都被关在笼子里，随机分为四组，每组10只小鼠：（1）PEP低剂量组（LP）：小鼠口服给药每公斤体重0.2克PEP；（2）PEP中剂量组（MP）：小鼠口服给药每公斤体重0.4克PEP；（3）PEP高剂量组（HP）：小鼠口服给药每公斤体重0.8克PEP；（4）对照组（蒸馏水）。所有小鼠口服给予PEP或蒸馏水在实验周期上午9:00左右灌胃。每只小鼠口服给药量根据每天的体重进行调整。在实验期6周后，收集小鼠粪便，用于粪便DNA提取。二乙基乙醚麻醉，颈椎脱臼法处死实验小鼠，在无菌条件下，冷板上纵向解剖获得内容物，每节内容物分成3等份，保存在20−°C用于短链脂肪酸浓度、水分含量、pH值测定。
Miseq测序
       16S细菌扩增子测序区段为：（V4）。
材料和化学品
       新鲜杏鲍菇购买自当地。6种高纯度的SCFA（短链脂肪酸）（乙酸、丙酸、i-butyric acids、n-butyric acids、i-valeric acids、n-valeric acids）用于标准溶液的制备。
实验动物
       C57BL／6雄性小鼠（6周龄）体重20± 2克，动物适应以下环境两周：温度，25 ± 2 °C；相对湿度，50 ± 5%；12/12小时光暗循环。整个实验过程接受标准饮食。
PEP的制备与表征分析
        PEP制备是根据前期研究进行。PEP表征分析，包括纯度检测、均匀性和分子量测定、单糖组成分析、硫酸和糖醛酸含量测定、紫外（UV）光谱和傅里叶变换红外（FT-IR）光谱分析。
研究结果：
PEP基本结构
        PEP的纯度、分子量、单糖组成、硫酸根含量请见表1。在260 nm和280 nm处没有吸收峰，光谱分析表明PEP中没有核酸或蛋白质存在（图1a）。PEP的FT-IR光谱在500-4000cm⁻¹，3399.9 cm⁻¹位置广阔的伸展峰代表了羟基基团(–OH)，揭示了PEP多糖链较强的分子内与分子间相互作用（图1b）。

 
SCFA（短链脂肪酸）的测定
        对照组和不同剂量PEP口服小鼠的SCFA总浓度如图2所示：相对于对照组，MP和HP喂养组在盲肠具有显著较高的SCFA总浓度。相对于盲肠内容物，结肠内容物具有显著较低的SCFA总浓度。随着PEP剂量增加，盲肠和结肠内容物中的总SCFA浓度分别从13.41 ± 1.78 mmol L ⁻¹，5.91 ± 1.23 mmol L⁻¹增加到22.08 ±1.74 mmol L⁻¹ ，7.40 ± 1.65mmol L⁻¹。

 
       相对于对照组，高剂量PEP喂养组（HP）在盲肠具有显著较高的乙酸浓度（图3a），然而结肠在对照组和PEP喂养组无显著变化。相对于对照组，高剂量PEP喂养组（HP）在盲肠具有显著较高的丙酸浓度（图3b），然而结肠在对照组和PEP喂养组无显著变化。相对于对照组，高剂量PEP喂养组（HP）在盲肠具有显著较高的两种丁酸浓度（图3c,d）。相对于对照组，高剂量PEP喂养组（HP）在盲肠和结肠都具有显著较高的i-valeric浓度（图3e）。而n-valeric在对照组和PEP喂养组的盲肠无显著变化（图3f）。

结肠和盲肠内容物pH值和含水量
        口服PEP后，结肠和盲肠内容物的pH值随着PEP剂量增加而降低（图4a），这可能是由于胃肠道微生物的PEP发酵产物所致。口服PEP后，结肠和盲肠内容物的含水量随着PEP剂量增加而升高（图4b），这可以归因于整个实验期间胃肠道内容物PEP强大的持水能力。

粪便微生物组成
        口服PEP 会导致粪便丰富度增加。厚壁菌、拟杆菌、变形杆菌是主要的门，相对于对照组，高剂量PEP喂养组厚壁菌门的相对丰度明显减少，而拟杆菌门明显增加（图5a）；纲水平，高剂量PEP喂养组Bacterioidia 和Bacilli的相对丰度增加, Clostridia的相对丰度减少（图5b）；目水平，高剂量PEP喂养组Bacteroidales和Lactobacillales的相对丰度显著增加，Clostridiales的相对丰度减少（图5c）；科水平，高剂量PEP喂养组Porphyromonadaceae，Rikenellaceae，Bacteroidaceae，Lactobacillaceae的相对丰度显著增加，Lachnospiraceae and Ruminococcaceae的相对丰度减少（图5d）;

 
       小鼠粪便菌群热图表明低剂量PEP喂养组和对照组的粪便菌群比较类似，中剂量PEP喂养组和高低剂量PEP喂养组的粪便菌群比较接近（图6）。

 
        PCoA分析显示各组间微生物群落具有差异性（图7）。

 
免疫应答分析
        在全程灌胃期间，不同组别每星期小鼠体重变化没有差异，说明不同处理组小鼠的健康状况相同。脾脏、肝脏和胸腺指数如下表2所示。相对于对照组，高剂量PEP喂养组胸腺指数具有非常显著性差异（p＜0.01），脾脏、肝脏指数则有显著性差异（p＜0.05）。 各组血清及肠内容物中的免疫细胞因子分泌情况如图8所示。PEP处理后血清IL-12浓度无显著变化。然而，相对于对照组，高剂量PEP喂养组的血清TNF-α，IFN-γ，IL-1，IL-2， IL-6和盲肠和结肠SlgA显著增加，提示了PEP的免疫功能调节作用。

总结：
        对照组与高剂量PEP喂养组（HP）小鼠盲肠和结肠内容物的短链脂肪酸浓度、pH值和水分含量显著不同。
        对照组与PEP处理组的粪便菌群结构有显著差异， 紫单胞菌科、理研菌科、拟杆菌科、乳杆菌科丰度均在PEP处理组增加。

        高剂量PEP口服给药后的免疫反应显著改变。这项探索性研究表明PEP的摄入对胃肠道健康有积极作用。

关于天昊：
       天昊生物采用Miseq PE250测序策略对细菌16S rDNA区/真菌ITS区/真菌18S rDNA区的双V区或多种单V区进行测序，使用低循环数扩增，保证每个样品扩增的循环数统一；采用特殊方法可有效避免系统内误差；数据质量高，有效序列Q30达到90%以上；加上最新升级的分析内容和解释详尽的结题报告，带您享受极致的微生物扩增子测序体验。