南京农业大学食品科学与技术学院近期在《Journal of Agricultural and Food Chemistry》上发表了苦丁茶中二咖啡酰奎宁酸对肠道微生态调节作用的文章。在恭喜天昊生物客户发表微生物文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。
英文题目：Modulating Effects of Dicaffeoylquinic Acids from Ilex Kudingcha on Intestinal Microecology in vitro 
中文题目：苦丁茶中二咖啡酰奎宁酸对肠道微生态的调节作用
期刊名：Journal of Agricultural and Food Chemistry     
发表时间： 2017年10月    影响因子： 3.1540
材料方法:
实验设计
        体外发酵实验共包含11组：一组不加碳水化合物（BLK）和四组包含不同碳水化合物（Glu，SUC，GOS和INL）；一个原始状态组(OR)和五组添加苦丁茶二咖啡酰奎宁酸（diCQAs）。
材料与试剂
       苦丁茶、葡萄糖（Glu）、蔗糖（SUC）、菊粉（INL）、糖麻（GOS）、乙酸、丙酸、n-butyric、i-butyric、n-valeric、i-valeric、2-ethylbutyric acids、甲醇、甲酸。
diCQAs制备
       苦丁茶diCQAs根据报道方法进行一些修改：苦丁茶用热水提取，产生的输液过滤，冷却至室温，装上大孔树脂柱吸附，用紫外分光光度计在线监测柱，用纯水洗脱，直到出水在325 nm处不吸收，用乙醇溶液（70%，v/v）洗脱目标部位，收集出水真空浓缩、冷冻冻干。
体外厌氧发酵
       使用粪便微生物体外厌氧发酵的方法来调查diCQAs对肠道菌群的影响。粪便样品从4名健康志愿者获得（2名男性和2名女性，22 - 28岁），没有任何胃肠道疾病或在过去的3个月没服用任何抗生素、益生菌、益生元、泻药。将粪便样品混合在一起，用蒸压生理盐水溶液稀释10次，得到10%（w／v）悬浮液。悬浮液离心4℃，而上清液用于下面发酵的粪浆。准备基础营养生长培养基，葡萄糖（Glu）、蔗糖（SUC）、菊粉（INL）、糖麻（GOS）（10 g/L）分别添加到培养基中。微生物发酵系统由2毫升粪浆和18毫升培养基组成。不添加diCQAs含葡萄糖、蔗糖，糖麻、菊粉、不加任何碳水化合物分别定义为GLU, SUC, GOS, INL,BLK；而添加diCQAs (1.0 g/L) 含葡萄糖、蔗糖，糖麻、菊粉、不加任何碳水化合物分别定义为GLUD, SUCD, GOSD, INLD, BLKD。每个体外发酵试验包含3个生物学重复。发酵系统在MGC缺氧密闭系统进行，37℃孵育24 h。每6小时轻轻摇动，使发酵系统尽可能均匀。培养后，采样用于细菌DNA提取，冻在20℃用于SCFA分析。
Miseq测序
细菌测序区段为：（V4）
 
研究结果：
厌氧发酵后菌群的丰富度和多样性。
        33个样本的平均测序数据量（clean data）为43029 ± 6733 序列。共检测到316 个OTUs，平均每个样本检测到160 ± 21 OTUs。稀释性曲线和Shannon曲线表明大多数物种被检测到（图1）。

        α多样性指数如表1所示：INL组微生物多样性最低，而BLK组微生物多样性最高。与不添加diCQAs组相比，添加苦丁茶diCQAs增加了α多样性。无碳水化合物培养时，diCQAs添加会降低微生物多样性(与BLK相比，BLKD的Shannon指数更低，而Simpson指数更高)。据报道，肠道菌群多样性与宿主健康密切相关，肥胖个体肠道微生物多样性显著低于瘦肉型个体，Shannon指数与脂肪组织呈显著负相关。本研究结果表明：diCQAs能增加肠道菌群多样性，表明苦丁茶的diCQAs具有通过调节肠道菌群抵抗肥胖的能力。

diCQAs对整体微生物结构影响
        聚类分析结果表明，所有样品可分为两个主要群体：diCQAs添加组和无diCQAs组，无碳水化合物添加发酵组(BLK和BLKD)与diCQAs添加组比较相近，OR组与无diCQAs组比较类似（图2a）。
        不同类型碳水化合物添加发酵组可以分为不同的亚群，但是它们之间的距离小于diCQAs引起的距离（图2b）。
        NMDS分析表明diCQAs添加组(GLUD, SUCD, GOSD, INLD, 绿色圈)和无diCQAs组(GLU, SUC, GOS, INL, 蓝色圈)在Axis 1完全分离，说明它们之间有明显差异（图2c）。
        CCA分析表明DiCQAs对体外发酵的影响要明显大于碳水化合物（葡萄糖、蔗糖、糖麻和菊粉）影响，这表明DiCQAs是肠道菌群的主要调节因素。

门和属水平微生物群落组成
        所有的发酵样品主要包括厚壁菌，拟杆菌，变形菌、放线菌、梭杆菌（图3a）。
        添加diCQAs降低了各类型碳水化合物条件下厚壁菌门的相对丰度（图3b）。
        DiCQAs对拟杆菌的相对丰度影响不大，除了GOS作为碳源时DiCQAs显著降低其丰度（图3c）。
        在所有碳水化合物甚至不加碳水化合物条件下，添加DiCQAs降低了厚壁菌门/拟杆菌门（F / B）比例（图3d）。肠道菌群的吸收能力与F / B值密切相关，添加DiCQAs导致F / B值降低预示着其抗肥胖的潜在能力。
        添加DiCQAs显著增加放线菌丰度，特别是在GOS发酵组（图3e）。类似于DiCQAs，槲皮素和儿茶素已被报道可以提高放线菌丰度，但葛根素则没有这种能力。

 
        属水平微生物组成图显示（图4），DiCQAs可以增加碳水化合物发酵组中Bacteroides（拟杆菌）,  Bifidobacterium（双歧杆菌）和 Escherichia/Shigella（大肠杆菌/志贺菌）的丰度，同时降低Prevotella（普氏菌）,  Megamonas（巨单胞菌）, Dialister（嗜血杆菌），Anaerostipes丰度。值得注意的是，GOSD组双歧杆菌的丰度高于GOS组和其它DiCQAs添加组，表明α- GOS和DiCQAs可协同促进双歧杆菌增殖。 DiCQAs对微生物组成差异的影响
        LEfSe分析显示在葡萄糖、蔗糖、糖麻和菊粉存在情况下，添加diCQAs可以分别增加20, 17, 20和22个属丰度（其中有14个属是组间共有），也可以分别减少10，10，11，8个属丰度（其中有6个属是组间共有）（图5）。

        把无diCQAs组(GLU, SUC, GOS, INL)定义为C群，diCQAs添加组(GLUD, SUCD, GOSD, INLD)定义为CD群。C群和CD群的差异趋势与上面不同碳水化合物条件得到的比较结果一致。在门水平，CD组比C组具有较高丰度的放线菌门和变形菌门，而厚壁菌门在C组更常见。在纲水平，添加diCQAs减少了Negativicutes丰度, 增加了放线菌纲,芽孢杆菌纲,γ-变形菌纲，α-变形菌纲丰度。在科水平，添加diCQAs增加了双歧杆菌科等12个物种丰度，同时抑制了Sreptococcaceae, Prevotellaceae,Veillonellaceae等物种丰度。很显然，diCQAs表现出对双歧杆菌增殖显著的正效应。而双歧杆菌是一种被广泛研究的益生菌，它能降低肥胖的风险和发生率，其丰度与肥胖者内毒素水平呈负相关。其促进健康的机制涉及多种作用，如粘附到肠上皮细胞，产生有益的代谢产物，增强肠道屏障，调节免疫反应，以及竞争性排斥病原体。

diCQAs对短链脂肪酸（SCFA）的影响
        大肠是人类产生短链脂肪酸的主要场所，栖息在那里的肠道微生物起着至关重要的作用。有机酸，包括乳酸、丙酮酸和乙酸，都来自碳水化合物的发酵，也可以由微生物进一步转化为丙酸和丁酸。短链脂肪酸对维持人体健康具有多功能，并能保护肠黏膜屏障，降低炎症反应水平，刺激肠胃蠕动。丁酸是一种重要的微生物代谢产物，它是结肠上皮细胞的主要能量来源，具有调节宿主基因表达，细胞分化和凋亡的功能。乙酸能促进肠粘液分泌，丙酸可能在调节食欲方面起关键作用。
        本文短链脂肪酸（SCFA）分析结果如表2所示，在所有的短链脂肪酸中，乙酸，丙酸和乳酸是最丰富的有机酸，丁酸也占一定比例。在无任何碳水化合物条件下，diCQAs抑制所有有机酸（除乳酸）和总酸，例如在它们的浓度在BLKD组中较BLK组低。在任何碳水化合物条件下，添加diCQAs可促进乙酸和乳酸产生，例如 (GLUD, SUCD, GOSD)组较(GLU, SUC, GOS)组多；添加diCQAs可减少丙酸和n-butyric（正丁酸）的含量。此外，BLK组的i-butyric, n-butyric，i-valeric 浓度最高。

总结：
        膳食多酚已被视为新的益生元，多酚可以通过调节肠道菌群发挥作用。苦丁茶的多种生物活性可能来源于它的酚类化合物，但苦丁茶中二咖啡酰奎尼酸（diCQAs）对肠道菌群的影响目前没有被调查过。研究发现diCQAs可以提高微生物多样性，并且diCQAs对微生物的影响高于碳水化合物（葡萄糖、蔗糖、糖麻和菊粉）对微生物的影响。添加DiCQAs可以增加拟杆菌、双歧杆菌、梭状芽孢杆菌、志贺氏菌等菌相对丰度，降低瘤胃球菌，小杆菌，巨型球菌等菌相对丰度。DiCQAs也可以通过微生物影响了短链脂肪酸的产生，例如乙酸和乳酸含量增加，丙酸和丁酸生成减少。总的来说，苦丁茶中的二咖啡酰奎尼酸（diCQAs）在体外对肠道菌群有显著的调节作用，这表明diCQAs具有被开发成功能性食品的潜力，通过促进肠道健康预防疾病的发生。

关于天昊：
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