喜讯！天昊SSRSeq新技术揭示萝卜种质资源种间和种内遗传变异及系统发育关系

原创上海天昊生物

客户“昊”文章

近日，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所领衔，南京农业大学、浙江省农业科学院蔬菜研究所和上海天昊生物参加，在著名生物学期刊《Biology》发表了题为“SSR-Sequencing Reveals the Inter- and Intraspecific Genetic Variation and Phylogenetic Relationships among an Extensive Collection of Radish (Raphanus) Germplasm Resources”的研究论文。该研究利用天昊生物SSR基因分型SSRSeq^TM专利技术，对939份萝卜种质资源种间和种内的遗传变异及系统发育关系进行了系统的研究。

中文题目：SSR测序揭示萝卜种质资源种间和种内遗传变异及系统发育关系

期刊名：Biology

发表时间：2021年11月30日

影响因子：5.079（JCR: Q1）

研究摘要

萝卜是十字花科的一个重要属，经历了漫长的进化过程。然而，种间和种内的系统发育关系和遗传多样性还不清楚。为了阐明这些问题，研究者对939份野生、半野生和栽培种质进行了SSR测序，分析发现欧洲作为萝卜的起源中心，有多种野生萝卜，遗传多样性丰富；欧洲、南亚和东亚可能是三个独立的栽培萝卜演化中心。在欧洲栽培萝卜中存在相当大的遗传分化。欧洲原始栽培萝卜与黑萝卜/油萝卜和鼠尾萝卜之间存在基因流。在亚洲栽培萝卜中，南亚的鼠尾萝卜是东亚中国大萝卜(包括日本野生萝卜)分支的姊妹变种，这表明它们可能有最近的共同祖先。日本野生萝卜与日韩大萝卜、油萝卜、鼠尾萝卜之间有较强的基因交流。美国野生萝卜是由欧洲野生萝卜和欧洲樱桃萝卜自然杂交演化而成。这些结果均表明，欧洲原始栽培型、美国野生萝卜和日本野生萝卜可能在萝卜进化中发挥了不可或缺的作用。本研究为萝卜的起源、进化和遗传多样性研究提供了新的视角，有利于萝卜种质资源的保护和开发。

研究背景

萝卜属种类繁多，变异丰富，可分为栽培萝卜（Raphanus sativus L. 2n=18）和野生萝卜（Raphanus raphanistrun L. 2n=18）两个种。其中，分类明确的野生萝卜包括2个变种，而栽培萝卜分为5个变种，在世界范围内广泛种植。

遗传多样性是萝卜进化和分化的基础。前人利用多种分子标记方法对萝卜种质资源的亲缘关系和分类进行过研究，但大都基于来源有限的栽培材料，很少关注基因多样性及其分布。SSR又叫微卫星DNA（Microsatellite DNA），由2-6个碱基作为基元，重复串联组成DNA序列，分布于整个基因组中的编码与非编码区域。由于重复性好、多态性高、共显性遗传、基因组中含量丰富且覆盖性较高等特点，不仅可用于种质资源遗传多样性分析和亲缘关系鉴定，确定其分类地位；同时还可以用于鉴别杂合子和纯合子，在杂交品种的种子纯度和真伪性鉴定方面具有明显的优势。

但是传统的SSR检测方法存在不足，例如琼脂糖凝胶电泳，具有便宜、操作方便，分辨率一般大于20bp，但DNA需要量大、分辨率低，片段相差小于20 bp时，结果不可靠。聚丙烯凝胶电泳分辨率优于琼脂糖凝胶，8%-10%的聚丙烯酰胺凝胶可以检测10-20bp差异以上的PCR产物，但操作比较繁琐，易出现漏胶，梳齿不齐等现象。两种传统SSR检测方法结果判读，都容易受条带不齐、背景模糊、泳带拖尾现象的影响，造成鉴定效果不理想，分析效率低。荧光毛细管电泳分辨率高于传统电泳方法，但是价格较贵，易出现假阳性，只能判断产物长度差异，无法检测SSR位点重复单元数。

采用天昊生物开发的基于二代高通量测序平台的SSRSeq^TM技术检测SSR扩增产物，弥补了传统SSR检测方法的不足，具有费用较低、通量大、效率高、分辨率高，精确到单碱基，SSR产物判读结果准确等优点。

本研究以萝卜全基因组为基础，设计了覆盖9条染色体的38对核心SSR引物，对939份萝卜种质进行了SSRSeq^TM技术分析。基于SSR标记的多样性，进一步分析了萝卜的遗传多样性和系统发育关系。研究结果为阐明萝卜遗传多样性分布、起源和进化轨迹提供了有价值的信息，为萝卜有效的种质收集和保存、优质基因挖掘和遗传改良奠定了良好的基础。

研究结果

本研究所用的939份栽培和野生萝卜材料保存在中国国家蔬菜种质中期库中，收集自中国31个省和日本、韩国、泰国、印度、德国、俄罗斯、西班牙、法国和美国等国家。野生资源包括两个亚种。栽培种质资源包括黑萝卜、樱桃萝卜、鼠尾萝卜、油萝卜、东亚栽培萝卜(EACR)(包括中国大萝卜和日韩大萝卜)和欧洲原始栽培萝卜(EPCR)。

本研究基于对萝卜全基因组序列信息的分析，设计了600对分布于萝卜全基因组的SSR引物。经聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选和毛细管电泳确认，获得38对高度稳定的多态性SSR引物。这些引物相对均匀地分布在9条萝卜染色体上。通过对各样本目标SSR区段的高通量测序，检测SSR重复序列长度差异和重复单元数以及频率的不同。结果显示，该方法的应用能够准确、高效地对国内、外收集保存的939份萝卜种质资源的遗传变异进行鉴定，并能很好地显示它们之间的演化关系和分类地位。利用本发明提供的38对SSR引物和多重PCR反应体系，结合SSRSeq^TM技术，为萝卜种质资源的收集、保存、鉴定、分类、挖掘和创新，以及育种材料的遗传背景鉴定和分子标记辅助育种等研发工作提供了分子层面的有效支持。

表1、不同野生和栽培萝卜群体的遗传多样性估算

图1、939份萝卜种质资源群体结构分析. (A) 群体结构分析 (K = 2). (B) ΔK 分析显示K = 2 对于所有萝卜种质资源是最佳的 (图1A)，表明所有萝卜种质资源可以明显的区分为栽培萝卜（黄色线条）和野生萝卜（蓝色线条）

图2、利用SSRSeq^TM和38对SSR引物揭示939份萝卜种质资源系统发育关系

图3、939份萝卜种质资源PCoA分析

图4、不同栽培萝卜和野生萝卜群体间的基因流。条形图的颜色表示迁移权重，箭头表示基因流动的方向。

综上所述，本研究首次利用萝卜全基因组38对核心SSR引物对939份萝卜材料的遗传变异进行了有效鉴定。遗传多样性分析显示，欧洲野生萝卜群体（EWR）的遗传多样性最高，表明欧洲是萝卜的起源地。欧洲原始栽培类型（EPCR）、中国大萝卜（CBR）和日韩大萝卜（JKBR）群体的遗传多样性相对较高，其次是油萝卜（OR）、鼠尾萝卜（RTR）和樱桃萝卜（ESR），这表明欧洲、南亚和东亚可能是独立的萝卜驯化中心。系统发育分析、群体结构分析和PCoA分析的结合有效地区分了EWR和栽培萝卜群体，并表明了野生种和栽培种各亚种或变种之间的遗传关系。基因流分析还表明，AWR是ESR和野生萝卜的后代。本研究对萝卜的遗传多样性及其分布、起源和演化有了一个全面的了解。研究结果将有助于萝卜种质资源的深入研究和利用。

SSRSeq^TM技术能高通量精准鉴定各SSR位点重复序列及其单元数，可以有效地应用于萝卜种质资源的遗传多样性分析和亲缘关系研究，对于探索种质资源的背景信息、进行分类和遗传改良研究以及保护育种者的知识产权具有很高的价值。

中国农业科学院蔬菜花卉研究所博士生李晓曼为论文的第一作者，中国农业科学院蔬菜花卉研究所李锡香研究员和南京农业大学柳李旺教授为共同通讯作者。共同作者中还包括上海天昊生物的李才华、桂雯婷和蔡斌。本研究得到了中国科技部国家重点研发计划(2016YFD0100204-02)、国家自然科学基金项目(31772303)、中国农业科学院科技创新工程计划(CAAS-ASTIP-2019-IVFCAAS、CAAS-XTCX2016016-4-4、CAASXTCX2016001-5-2、CAAS-XTCX2016017)的资助。

基于二代测序平台的SSR^TM分型专利技术：