专利技术新文 | 天昊Accu16S细菌绝对定量测序专利技术在帕金森病研究中的新进展

英文题目：Network Pharmacology and Absolute Bacterial Quantification-Combined Approach to Explore the Mechanism of Tianqi Pingchan Granule Against 6-OHDA-Induced Parkinson’s Disease in Rats

中文题目：利用网络药理学与细菌绝对定量相结合的方法探讨天芪平颤颗粒抗6-OHDA诱发大鼠帕金森病的作用机制

期刊名：Frontiers in Nutrition

发表时间：2022年5月6日

影响因子：6.576

帕金森病(PD)是一种常见的神经退行性疾病，其病症表现为运动迟缓、静止性震颤、肌强直和胃肠功能障碍，例如便秘等。天芪平颤颗粒（TPG）是临床上治疗PD的有效中药方剂。然而，TPG在PD治疗中作用机制仍不清楚。

本研究通过网络药理学和大鼠体内实验相结合的方法，揭示了TPG治疗PD的机制，详细技术路线如图1所示。

研究首先利用网络药理学分析方法，通过TPG的药理信息检索自中药数据库与分析平台（TCMSP），进行了化合物分析和疾病靶点鉴定。在网络构建时，使用了来自Therapeutic Target Database（TTD）、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）、GeneCards和DrugBank数据库的PD差异表达基因数据，并使用STRING数据库构建了蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，还进行了GO和KEGG通路富集分析，最后通过人工整合了参与PD发病机制直接相关的通路。

之后，研究利用6-羟基多巴胺(6-OHDA)注入成年雄性大鼠右前脑中束来建立PD大鼠模型。所有大鼠随机分为三组（每组n = 4只大鼠）Sham组、PD组和TPG组。TPG组大鼠每天同时灌胃TPG（5.6 g/kg）一次。假手术Sham对照组大鼠和PD组大鼠单独灌胃无菌生理盐水。收集所有大鼠最后一次治疗后第二天的粪便，放入无菌EP管中后储存在-80ºC，之后送上海天昊生物公司进行Accu16S^®细菌绝对定量测序检测。此外，还利用大鼠的血液样本，通过ELISA实验分析了血清炎性细胞因子的浓度，并利用免疫组化实验，观察了大鼠脑组织中小胶质细胞增生和星形胶质细胞增生的情况。

图1、技术路线图

在TPG有效成分分析中，研究者在对TCMSP数据库的初步搜索后，确定了73种潜在相关的活性成分。最后选择63种成分作为候选生物活性成分进行进一步分析。在靶点的鉴定中，对63种活性化合物的基因靶点检索后得到1,542个靶点。去掉重叠部分后，最终确定了235个 TPG靶点，此外利用TTD、OMIM、GeneCards和DrugBank 数据库识别767个PD相关靶基因。

图2A为药物靶基因和疾病相关基因维恩图，一共得到了99个重叠靶基因。使用Cytoscape构建了“TPG-Targets-PD”网络（图2B）。具有最高程度中心性(DC)的前五种化合物是槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇和7- O-甲基异木糖醛醇。为了深入探索上述靶点之间的相互作用，研究者构建了PPI网络（图2C）。

之后还利用Metascape对99个重叠的TPG和PD目标的GO和KEGG途径进行功能富集。KEGG分析显示，许多靶基因与NF-κB信号通路和T细胞受体信号通路密切相关。GO分析结果发现，相互作用靶点主要与对脂多糖反应及其介导的信号通路、分泌的调节、炎症反应、TNF反应和神经胶质细胞的发育有关。

利用Accu16S^®细菌绝对定量测序，首先分析了肠道菌群的多样性变化。与PD组(E)大鼠相比，Sham组(D)大鼠和TPG组(F)大鼠的Chao1和ACE的α多样性指数往往较低（图3A、B），而Shannon指数更高，但三组间无显着差异，提示样本数量有待扩大。

为了进一步分析三组肠道菌群组成的异同，研究进行了样本聚类树分析。值得注意的是，从图3D可以清楚地看到，样本按分组聚集，表明PD组的微生物组成与Sham组和TPG组微生物组成不同。此外，β多样性指数的非度量多维尺度方法（NMDS）和主坐标分析（PCoA）分析，也有类似的结果（图4E，F)，可以发现TPG组和Sham组的差异不明显，说明TPG对照组和Sham组的肠道菌群组成相似。

图3、肠道菌群多样性变化（n=4只/组）：（A-C）三组的Chao1指数、ACE指数和Shannon指数；(D)样本聚类树分析；（E）NMDS分析。(F) PCoA分析。（原文图4）

此外，线性判别分析效应大小(LEfSe)分析用于区分Sham、PD和TPG组的特定优势菌的情况，PD组与其他组差异如图4所示。

从纲分类水平分析，发现与Sham组相比，PD组中Negativicutes的丰度显著下降，而Mollicutes则显著增加。而TPG组中Negativicutes又明显高于PD组大鼠（图5A-C）。在目分类水平，与Sham组大鼠相比，PD组大鼠中观察到Selenomonadales的减少，和Enterobacteriales与Mycoplasmatales的增加（图6D-F）。随着TPG的处理，Selenomonadales和Aeromonadales的丰度增加。此外，三组之间的肠道微生物在科（图6G）、属（图6H ）和物种（图6I）水平也有明显差异。这些数据表明PD大鼠肠道微生物失调，TPG可以调节微生物群组成以改善PD大鼠的肠道微生物失调。

鉴于肠道微生物菌群失调与功能变化密切相关，研究者还进行了肠道菌群的功能预测分析（图6）。可以看出，与PD组相比，TPG组黄酮类生物合成相关的功能显著上调。越来越多的科学证据表明，类黄酮具有抗炎特性。

之后，研究者探讨了TPG对受损纹状体神经炎症的影响。研究发现TPG可以减轻炎症反应，正如预期的那样，与PD组相比，TPG组的血清外周炎性细胞因子显著降低。此外，免疫组化IHC数据显示，6-OHDA可显著增加PD组大鼠Iba-1和GFAP的表达。TPG给药在很大程度上抑制了PD大鼠黑质中小胶质细胞和星形胶质细胞的活性。

本研究对TPG的网络药理学分析，鉴定了与PD相关的73个化合物和235个靶基因。根据通路富集分析及16S rRNA测序结合的方法，验证了TPG可以改善肠道菌群，抑制PD的炎症反应，成功揭示了TPG在抗PD中的作用机制。