项目新文：天昊Accu16S细菌绝对定量测序在中药治疗阴道炎研究中的新成果

阴道炎是女性最常见疾病之一。最常见的阴道炎类型包括：细菌性阴道炎(BV)、滴虫性阴道炎(TV)、外阴阴道念珠菌病(VVC)和需氧性阴道炎(AV)。混合性阴道炎是指同时存在至少两种阴道病原体，其比单一病原体感染更复杂。

例如患有AV+BV的女性通常进行抗生素治疗，这会使阴道生态系统失衡。中医（TCM）被认为是AV+BV的替代疗法。临床研究表明，以中药治疗阴道炎，如复方芙蓉泡腾栓，不仅可以消毒止痒，还可以相对减少对阴道菌群的破坏。

高通量测序的进步极大地加速了对阴道微生物组和妇科疾病的研究。然而，该技术目前大多数是相对定量16S-seq (RQS)，没有考虑细菌的绝对含量。基于相对定量结果的不恰当解释，可能会得出一些错误的研究结论。因此，需要对细菌种群进行更加准确的绝对定量检测。

基于上述考虑，来自北京清华长庚医院等多家医疗单位合作，采用上海天昊生物的Accu16S^®细菌绝对定量测序技术（Accu16S），检测了阴道炎患者样本微生物的绝对丰度和相对丰度，更全面的评估了复方芙蓉泡腾栓治疗混合性阴道炎的初步疗效。

英文题目：Accurate 16S Absolute Quantification Sequencing Revealed Vaginal Microecological Composition and Dynamics During Mixed Vaginitis Treatment With Fufang FuRong Effervescent Suppository

中文题目：准确的16S绝对定量测序揭示复方芙蓉泡腾栓治疗混合性阴道炎的阴道微生态组成和动态

期刊名：Frontiers in Cellular and Infection Microbiology

发表时间：2022年5月13日

影响因子：5.293

研究者在2019年8月至2021年6月开展了一项多中心、随机、盲测和有平行阳性对照试验，评估复方芙蓉泡腾栓治疗AV合并BV的疗效。本研究分析了来自北京大学深圳医院、西安交通大学第一附属医院，重庆医科大学第二附属医院、山东大学齐鲁医院、徐州市中心医院、天津中医药大学第一附属医院和南京市妇幼保健院等7家医院（分布于中国东部、南部、西部、北部和中部）的患者临床数据和阴道拭子。

患者随机分为两组：阳性对照组（C组：克林霉素磷酸酯乳膏-克林霉素组）和实验组（T组：复方芙蓉泡腾栓-芙蓉组）。筛选期设定为基线（V1阶段：-2-0天）。在给药之前，所有参与者都接受了阴道片剂的培训。然后，两组患者连续用药12天（每晚1次）。在治疗期后3-5天（V2阶段：15-17天）和治疗期后28±3天（V3阶段：40±3天）回医院检测。每次回访，参与者接受了常规实验室检查，并取两份阴道拭子，一份用于Nugent和Donders的评分，另一份保留在-80ºC下，用于细菌Accu16S检测。本研究最终从80名患者中获得204个阴道拭子样本，经过质控最终成功获得170个样本用于分析。Accu16S检测是对阴道拭子样本提取的DNA，进行16S rDNA的V3-V4区段的绝对定量测序。

图1、Accu16S合格样品筛选流程图。（原文图2）

上述7家公立医院共纳入80名患者，两组之间的基线特征未检测到显着差异。临床疗效评估基于随访期间的Nugent和Donders评分。两组的AV和BV预后均有明显改善（图1）。

图2、克林霉素组和芙蓉组治疗前后的Nugent评分（A）和Donders评分（B）结果。（原文图1）

阴道拭子的绝对定量

Accu16S共使用了170个合格样品（图2）。经过质控后，共有34108020条reads用于后续分析。两组微生物群的α多样性指标Shannon和Simpson（两者都是常用的反映α多样性的指标。Shannon值越大，群落多样性越高。Simpson指数值越大，群落多样性越低。）如图3A、B所示。与最初未处理的样品相比，这些样品中细菌的多样性突然下降。基于170个样品中微生物β多样性的加权Unifrac矩阵聚类数据的PCoA如图3C（相对丰度）和3D（绝对丰度）所示。收集两组V1阶段的阴道样本，并将其与V2和V3阶段的阴道样本分开。此外，阴道微生物群组成在V2和V3阶段相似，与临床数据相似。绝对和相对定量不影响PCoA。

治疗后，两组细菌总丰度在V2阶段均急剧下降，但在V3阶段略有增加，尤其是芙蓉组（图4A）。在克林霉素治疗的V2阶段检测到总细菌量的最大损失。Gardnerella、Prevotella、Atopobium、Sneathia和Megasphaera是治疗前的优势菌（图4A）。这五种未经处理的细菌的绝对定量在两组之间没有差异，并且在处理后急剧下降（图5）。尽管克林霉素促进了强烈的杀菌作用，但Lactobacillus的绝对丰度在阴道内仍然略有增加。有趣的是，在芙蓉组中，Lactobacillus的绝对丰度也显着增加，而致病菌减少。V1阶段优势细菌的相对丰度与两组的绝对丰度相似（图4A）。但相对定量RQS结果显著放大了V2和V3阶段的Lactobacillus数量，这可能会误导判断。总体而言，相对定量可以在一定程度上反映细菌的变化趋势，但由于定量不准确会错误引导治疗。

三种细菌（Gardnerella、Prevotella和Atopobium）在两组的V3阶段都有微弱的增加（图4A）。因此，我们在每组的V1和V3阶段对这些细菌进行了Wilcoxon秩和检验。与克林霉素或芙蓉处理前相比，V3阶段病原菌的绝对丰度大大降低。同时，芙蓉组Lactobacillus绝对丰度明显高于未处理样品（p < 0.05），但与克林霉素组无差异（p> 0.05)。由于 16S 分析不能有效地在物种水平上对注释结果进行分类，我们手动比较了NCBI中的序列，以获得图4B中的结果。在两组中，Lactobacillus iners在Lactobacillus spp. 中占优势，之前其变化与Lactobacillus的总体趋势相似，两者均表现为处理后总量的增加，尤其是芙蓉组。此外。物种水平分析（图4B）证实，阴道Gardnerella vaginalis、Atopobium vaginae、Sneathia amnii和Prevotella bivia是主要病原菌。在属级别，图6确定了细菌群落组成的聚类模式，类似于使用PCoA观察到的分组模式。首先，Lactobacillus在两组的V2和V3阶段都成为阴道微生物群中的优势菌。其次，在治疗前的患者中检测到Gardnerella、Prevotella和Atopobium占优势，这与研究者之前的研究结果一致。

图6、阴道拭子样本中存在的17个最丰富的细菌属分布的热图。

总体而言，芙蓉组和克林霉素组在治疗后评分有所改善，两组治疗效率无显着差异。此外，Accu16S^®细菌绝对定量测序技术在准确评估阴道微生物组的动态和治疗期间的药物效果方面优于传统的相对定量RQS方法。最后结果证明，复方芙蓉泡腾栓治疗AV+BV的疗效与克林霉素相同，可以很好地促进阴道微生态的恢复。