原创 上海天昊生物
特发性肺纤维化（IPF）是一种进行性间质性肺部疾病，其分子机制尚不清楚。2022年9月21日Science Advances杂志在线发表了南开大学药学院周红刚教授和生命科学学院宁文教授合作的最新研究成果“丙酮酸激酶M2（PKM2）通过稳定TGF-β1受体I，增强TGF-β1信号通路促进肺纤维化”，该研究证实了PKM2作为纤维化进展中的关键因子。天昊生物有幸参与了本研究中的小鼠原代成纤维细胞的RNA-seq及分析工作。
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特发性肺纤维化（IPF）是一种慢性、进行性、致死性的间质性肺疾病，确诊后患者的平均预期寿命为3-5年，IPF的病因尚不明确。大量证据表明，转化生长因子β（TGF-β1）信号在纤维化进展中发挥核心作用。高活性的TGF-β1与TGF-β Ⅱ型受体（TβR2）结合，并诱导其与TβR1组装。TβR1反过来通过磷酸化受体调节的Smads（R-Smads），Smad2和Smad3来启动细胞内信号，然后磷酸化的R-Smad易位到细胞核内并启动基因表达。因此，R-Smad的磷酸化是TGF-β1信号激活的直接证据。另外，通过Smad7介导的泛素化下调TGF-β1信号通路已被广泛研究。Smad7在TGF-β1信号的负反馈回路中的关键作用使其参与了纤维化的发生，而促进Smad7的功能可能对纤维化治疗有益。
丙酮酸激酶M2（PKM2）催化糖酵解的最后一步。PKM2在胚胎细胞中高表达，并受到复杂的变构调节以执行不同的生物学功能。PKM2四聚体是一种调节糖酵解和氧化磷酸化的高活性丙酮酸激酶，而PKM2二聚体是一种蛋白激酶，通过易位到细胞核来启动基因转录。这一特性使PKM2能够在代谢和非代谢方面促进细胞增殖。因此，PKM2优先表达于大多数类型的癌症和一些纤维化疾病，如非酒精性脂肪性肝炎和肾纤维化。目前的研究主要集中在PKM2的代谢和转录功能，然而，PKM2在调节信号转导中的作用尚不清楚。有研究报道PKM2可以调节经典和非经典TGF-β1信号通路，但分子机制的细节尚不清楚。
为了确定PKM2在肺纤维化中的作用，首先分析了公共数据中发现PKM2 mRNA水平随IPF进展显著升高，而且与IPF标志物ACTA2和COL1A1水平呈正相关。在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织中也发现PKM2表达水平上升，其增加的表达主要位于原代肺成纤维细胞，而不是肺泡Ⅱ型（AT2）细胞。另外也观察到PKM2四聚体具有博来霉素处理时间依赖性，表明其四聚体在纤维化进展中具有一定作用。
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PKM2在IPF样本中的异常表达
为了研究PKM2在肺纤维化发病机制中的作用，团队构建了Pkm2条件性敲除（PKM2-KO）小鼠模型，和野生型（WT）小鼠分别经博来霉素处理。结果显示PKM2-KO小鼠的纤维化程度显著降低，胶原沉积显著减少，促纤维化因子α-SMA、胶原蛋白1和纤维连接蛋白的蛋白表达也显著降低。鉴于TGF-β1信号通路在纤维化进展中的关键作用，进一步研究了Smad3下游TGF-β1信号通路的激活，发现PKM2-KO小鼠的磷酸化Smad3（p-Smad3）水平比WT小鼠低得多，这表明PKM2 KO可能影响上游TGF-β1信号通路。综上所述，这些数据表明PKM2缺失保护小鼠免受博来霉素诱导的纤维生成、胶原沉积和TGF-β1信号激活。作者还利用脂质纳米粒子装载Pkm2干扰RNA在纤维化阶段敲低PKM2，结果发现同样能够预防纤维化进展。增值性的肌成纤维细胞的积累有助于纤维化灶的形成，对肺切片染色发现在PKM2-KO小鼠中增值性的肌成纤维细胞显著更少，表明Pkm2的缺失减轻了肌成纤维细胞的活化。接下来，作者研究了PKM2调节肌成纤维细胞活化的信号通路。利用RNA-seq来比较博来霉素处理的PKM2-KO小鼠和WT小鼠原代肺成纤维细胞的基因表达。在PKM2-KO组的1710个下调基因中确定了一系列高度参与纤维化进展的基因，这证实了Pkm2的缺失保护小鼠免受纤维化发生。为了进一步确认这些下调基因中关键的促纤维化基因，使用来自IPF患者的RNA-seq数据，比较了PKM2-KO成纤维细胞中下调的基因和IPF肺组织中上调的基因，共鉴定出219个共同的基因，对这219个基因的富集分析表明，其中许多基因控制TGF-β1信号、黏着斑和ECM-受体相互作用。RNA-seq分析表明PKM2对纤维化进展的影响可能与TGF-β1信号高度相关。![]()
RNA-seq揭示PKM2通过TGF-β1信号影响纤维化进展
为了研究PKM2在TGF-β1信号转导中的作用，作者利用shRNA靶向人293T细胞中PKM2。PKM2敲低抑制了TGF-β1反应性荧光素酶报告基因对TGF-β1的活性，减少了p-Smad3的数量，并进一步证实了PKM2主要通过其四聚体促进TGF-β1信号传导。接下来，分别利用共免疫沉淀、pull-down、微尺度热泳技术、分子对接分析、突变体构建等生化实验证实了PKM2通过与Smad7直接作用调控TGF-β1信号。而且通过实验发现PKM2干扰Smad7与TβR1的结合，并抵消了Smad7活性。机制上，PKM2调节TβR1的泛素化和稳定性，从而增强TβR1信号通路。鉴于PKM2在293T细胞中调节TGF-β1信号，并且PKM2在博来霉素诱导的小鼠原代肺成纤维细胞中高度表达，下一步的研究则证实了PKM2调节人肺成纤维细胞TGF-β1信号通路。据报道，一些化合物能够调节PKM2聚合。作者选择了TEPP-46和化合物3k进一步测试在体外和体内通过药物调节PKM2聚合是否可以影响纤维化进展。通过DSS交联实验等证实了在体外，通过药物调节PKM2的构象可以干扰PKM2与Smad7的结合及TβR1的泛素化。最后，团队也研究了TEPP-46和化合物3k对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响，TEPP-46（30 mg/kg）和化合物3k（10 mg/kg）在博来霉素处理后的第14天到第21天通过口服灌胃给予。发现TEPP-46处理组的病理改变和胶原沉积较对照组更严重，而化合物3k处理显著减轻了肺结构塌陷和胶原沉积。这些结果表明，从药理学上调节PKM2的构象可能是缓解肺纤维化进展的潜在策略。![]()
模式图展示PKM2的过表达导致TβR1的持续稳定和肺纤维化的进展本研究中发现PKM2是TGF-β1信号通路的增强子，通过直接结合Smad7促进纤维生成。PKM2在肺纤维化进展过程中高表达。值得注意的是，PKM2四聚体的比例随着其总表达量的增加而升高。PKM2的缺失显著减轻博莱霉素诱导的肺纤维化和肌成纤维细胞活化。机制上，与Smad7结合的PKM2四聚体干扰了Smad7与TβR1的相互作用，从而降低了TβR1的泛素化和降解。通过药理学方法调控PKM2构象的改变，使其形成单体，对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化具有保护作用，可能是IPF治疗的潜在策略。
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