项目文章 | 西北乳糜泻患者肠道菌群及粪便代谢组特征分析

中文题目：西北乳糜泻患者肠道菌群及粪便代谢组特征分析

本研究招募了30例诊断为乳糜泻的患者和30名年龄、性别和种族匹配的健康受试者。按照标准操作获取受试者粪便样本，送上海天昊生物分别进行16S rDNA 扩增子测序（V3-V4区）和LC-MS非靶向代谢组检测，并进行了比较分析。同时建立随机森林模型来寻找疾病状态潜在生物标志物，并采用Pearson相关分析方法对差异代谢产物和差异菌群进行相关性分析。

本研究首先对受试者的基线特征进行了统计分析，结果表明CD患者组和HC健康对照组两组具有可比性（表1）。

表 1、CD患者组和HC健康对照组的基线特征表。

研究利用CD患者组和HC健康对照组的粪便样本进行了16S rDNA 扩增子测序，分析肠道微生物群多样性分析。从60份粪便样本中共获得4,024,566个高质量读序，以及4,799个ASV。在这些ASV中，978个在两个组中共享（图1）。

通过α多样性分析评估各组物种的丰度和多样性。结果表明，CD组肠道菌群的α多样性低于HC组。其中，Observed、Chao 1和ACE表明，CD组和HC组的微生物群落丰富度存在显著差异，而其他指标显示两组间差异无统计学意义（图2A）。

PCA和PCoA分析表明，CD组和HC组之间的粪便微生物群落结构存在显著分离(图2B，C)。计算基于UniFrac距离的ANOSIM分析也进一步表明组间细菌群落存在显著差异。

之后又比较了不同分类水平上微生物的相对丰度。在门和属水平上，发现了多种细菌存在差异（图3）。

为了筛选能够区分CD疾病状态和HC的生物标志物，构建了基于属水平的物种诊断模型。AUC-随机森林算法用于确定最大化 ROC 曲线的 AUC 值的最优随机森林模型。在CD组和HC组的验证队列中，按AUC值最高的重要性顺序选择了4个物种。最重要的四个物种是Clostridium_IV，Veillonella，Ruminococcus和Gemmiger（图4A）。AUC为0.85 (95%可信区间为0.754–0.951)(图4B)。

随后进行了粪便代谢物分析（图5）。OPLS-DA的结果显示，CD组和HC组的粪便代谢物谱存在差异，表明CD的粪便代谢产物发生了转化，两组之间的差异在代谢水平上得到了很好的体现。以OPLS-DA模型第一主成分的VIP >1和p <0.05为筛选条件，从CD和HC组中筛选出222种可注释的差异代谢物，包括25种上调和197种下调代谢物。筛选条件进一步调整，筛选条件设定为VIP>2.0，p<0.05。共筛选了CD组和HC组之间差异显著的13种代谢物（表2）。基于KEGG通路数据库获得代谢途径富集结果表明，不同的代谢物富含代谢途径。氨基酸的生物合成;精氨酸和脯氨酸代谢；不饱和脂肪酸的生物合成；烟酸和烟酰胺代谢以及氨酰基tRNA生物合成等。

图5、CD患者组间粪便代谢组学分析。（A）CD组和HC组之间的正交偏最小二乘区分分析（OPLS-DA）评分图；（B）火山图显示CD与HC组之间代谢物的差异；（C）构建由代谢物组成的随机森林模型以区分CD患者和HC健康对照。（D）可以区分CD和HC的前6种代谢物的ROC分析。（E）KEGG分析的气泡图，显示了差异表达代谢物富集在CD和HC组之间的前10种代谢途径。

最后，研究对CD相关差异微生物与代谢物进行了相关性分析。采用皮尔逊相关分析分析粪便代谢物与微生物组的关系（图6）。结果发现，Allisonella、Clostridium_IV、Ruminococcus和Christensenella与差异代谢物密切相关。例如Allisonella与二乙醇胺和4-胍基丁酰胺呈正相关。Clostridium_IV与硬脂酸、杨梅素、L-亮氨酸、蛋氨酸亚砜亚胺、β-谷甾醇、邻苯二甲酸二丁酯、异榄香霉素、甲酰亚胺谷氨酸、吗啡酮、石胆酸和对羟基苯甲酸丙酯呈正相关等。这些相关性表明，肠道菌群结构和代谢物的变化与宿主代谢密切相关。

图6、粪便微生物与代谢物之间的相关性分析。

在这项研究中，肠道微生物群和代谢物与多组学整合方法有关。相关性分析表明，革兰氏阳性菌（Clostridium_IV、克里斯滕塞氏瘤胃球菌）等革兰氏阳性菌的减少与氨基酸代谢、酯类、醇类等有机化合物密切相关。总体而言，这些结果表明肠道微生物群与代谢物之间存在显著的相互作用，可能影响CD的发生。通过研究一些代谢物与微生物群落之间的相关性，它最终可能有助于在治疗上操纵CD中微生物群落的功能（McHardy等人，2013;高达马拉朱等人，2017）。

本研究旨在利用16S rDNA测序和代谢组学分析中国西北地区乳糜泻诊断患者的粪便微生物组成和代谢组特征，并筛选可用于其诊断的潜在生物标志物。在CD组和健康对照组之间观察到肠道微生物群组成的显著差异。共鉴定出222种不同的粪便代谢物，提示乳糜泻患者存在单碳代谢缺陷。使用随机森林模型选择4种细菌和6种代谢物作为潜在的生物标志物。相关性分析表明，肠道微生物群的变化与粪便代谢物水平的变化显著相关。综上所述，本文研究了西北地区人类肠道菌群与CD的关系，突出了一些独特的微生物群和代谢特征，为研究人员探索补充特定营养的潜在有益作用开辟了一条新途径。本研究为未来制定潜在的诊疗靶点提供了实验依据。