客户新文—目的基因羟甲基化测序助力客户再发Journal of Hazardous Materials！

作者分别用1-NP和α酮戊二酸（α-KG，羟甲基化关键酶TET对其依赖）对怀孕小鼠进行干预处理，不同时期收集海马等组织样本进行检测，并对子代小鼠行为学进行检测（详见原文实验方法，如下图1）。

图1 动物实验方案及处理方法

行为学检测发现妊娠期1-NP暴露可诱发成年雄性后代的焦虑样行为。对海马组织的检测发现妊娠期1-NP暴露并不影响雄性成年小鼠海马腹侧神经元的存活。而海马腹侧突触损伤是1-NP暴露后雄性成年后代的主要影响。

进一步对突触相关蛋白进行检测，发现海马PSD95，一种兴奋性突触标志物在高剂量组成年雄性后代中降低。抑制性突触标志物桥尾蛋白（gephyrin）也在高剂量组降低（如下图2）。利用免疫荧光证实了上述蛋白的表达水平，表明妊娠期1-NP暴露降低了雄性后代突触相关蛋白的水平。

图2 妊娠期1-NP暴露下调了雄性后代中突触相关蛋白的水平

考虑到GD14是早期胎儿海马发育的重要时间点。由于GD14不能解剖小鼠海马，作者用前脑代替海马。结果也发现暴露于1-NP的胎儿的前脑中gephyrin蛋白减少。为了探讨抑制性突触形成减少的原因，对两种gephyrin相关基因Nrg1和Erbb4的mRNA表达进行了检测，发现在1-NP暴露的胎儿中，前脑Nrg1和Erbb4 mRNA下调（图3）。

接下来，检测Nrg1和Erbb4基因中的5hmc含量。Nrg1和Erbb4基因CpG片段的总5hmC含量无显著差异。有趣的是，在暴露于10 μg/kg 1-NP的胎儿中，Nrg1基因中两个CpG位点（32008909和32009239）的5hmC含量降低。此外，Erbb4基因中三个CpG位点（69107743、69107866和69107899）的5hmC含量在暴露于100 μg/kg 1-NP的胎儿中降低。检测胎儿前脑TET1、TET2、TET3表达及TET活性。尽管对Tet1、Tet2、Tet3 mRNA及其蛋白没有显著影响，但100 μg/kg 1-NP组胎儿前脑TET活性降低，相应地，100 μg/kg 1-NP组胎儿前脑α-KG含量降低（图3）。这些结果表明，妊娠期1-NP暴露降低了胎儿前脑TET活性和gephyrin相关基因的5hmC。

图3妊娠期1-NP暴露可通过抑制胎儿前脑TET活性降低gephyrin相关基因的5hmC

最后，作者也研究了α-KG对gephyrin相关基因的影响，证实了α-KG预处理可减弱1-NP诱导的胎儿前脑gephyrin相关基因的下调和雄性成年后代海马突触损伤。

综上所述，本研究探讨了妊娠期1-NP诱导成年雄性后代焦虑样行为的机制。研究结果表明，妊娠期暴露于1-NP会减少雄性成年后代腹侧海马体的树突分支、树突长度和树突棘密度。此外，妊娠期1-NP暴露改变了胎儿和成年雄性后代海马突触相关基因的表观遗传重编程。妊娠期1-NP暴露可通过降低α-KG和TET活性降低突触相关CpG位点的5hmC。α-KG预处理可减轻1-NP诱导的gephyrin相关基因下调、海马突触损伤和焦虑样行为（图4）。

图4 本研究机制图

当前的研究结果表明，妊娠期1-NP暴露部分通过改变雄性成年后代海马突触可塑性的表观遗传重编程导致焦虑样行为。这些结果提供了新的证据，表明早期暴露在环境压力下会改变发育中的大脑的表观遗传重编程，从而导致晚年的情感障碍。