项目文章 | 天昊微生物扩增子绝对定量测序在我国耕地生态保护领域新成果

中文题目：稻田非粮化整治对土壤细菌可持续生态功能保护的影响——来自中国浙江省的经验证据

“耕地非粮化”一词是指将原本用于粮食作物生产的耕地转为经济作物，甚至是改造为池塘养殖和畜牧业等农业生产。由于耕地是保障国家粮食安全的重要基础资源，非粮化生产过剩将严重影响粮食生产，从而在一定程度上影响国家粮食安全。优质的耕地资源，具备粮食生产和生态功能。然而，农民粮食生产收入低、农业结构调整等因素导致稻田“非粮化”程度提高。

土壤细菌是土壤生态系统不可或缺的组成部分，参与各种土壤物理生化过程，包括土壤有机质（SOM）的分解、腐殖质的形成以及养分的转化和循环。因此，土壤生态系统的质量和健康与土壤细菌群落结构的变化密切相关。根据现有研究，耕地的不同耕作和利用方法可以改变其土壤理化性质，包括pH、有机碳、速效钾（AK）和水分含量，显著影响土壤细菌，但其对长江中下游重点水稻产区土壤细菌生态功能的影响知之甚少。另外，先前涉及高通量测序实验的研究得出结论，土地固结可以优化农田中的土壤细菌群落。然而，仅采用传统高通量扩增子测序来研究土壤细菌的群落结构，只能得到群落结构的物种信息和相对丰度，而不能提供绝对丰度信息，这是评估生态系统群落结构的三个关键要素之一。绝对丰度是评估细菌群落结构的关键指标，没有绝对丰度意味着无法准确反映细菌群落的真实数量。因此，通过天昊生物创新地结合土壤细菌的相对丰度和绝对丰度指标，探讨稻田NGC对土壤细菌多样性及其生态功能的影响机制，将对区域性土壤细菌的可持续生态功能保护具有重要的理论和实践意义。

本研究以稻田NGC实施前后的土壤样本为研究对象。从这些样品中提取土壤细菌DNA，并进行天昊生物16S rDNA扩增子绝对定量测序，探讨稻田NGC对土壤细菌群落的影响。希望研究结果能为实现耕地NGC的土壤细菌可持续生态功能保护提供基础数据和支撑证据。

本研究选取浙江省嘉兴市和湖州市进行耕地NGC的项目区进行实验。在实施耕地NGC之前（A组）和之后（B组）收集土壤样本（图1）。根据项目区土地利用调查数据，样地的作物栽培状况如表1所示。所有样品均在没有降雨的情况下收集。采用S形多点采样方法收集0-10 cm表层土，将其均匀混合形成单个土壤样品，每个样品重500 g。九个项目区编号为01至09，共收集18个样品。从每个样品中称出20 g储存在-80℃冰箱中，后送上海天昊生物进行土壤的Accu16S^®细菌绝对定量测序（V3-V4区）。剩余土壤样品用于土壤理化测试，包括土壤水分指数（SMI）、pH值、土壤有机质含量（SOM）、速效磷（AP）、速效钾（AK）、全氮（TN）和土地破碎度（FIQ）。

图1、研究区域和采样点分布示意图。

NGC对土壤环境因子的影响

18份土壤样品中环境因子的变化特征的比较结果表明，不同空间位置的土壤样品理化性质存在显著差异，这说明土壤中存在空间异质性。本研究侧重于稻田NGC实施前后土壤及其微生物的变化，因此后续分析主要缩小到通过比较A组和B组的数据来分析稻田NGC对土壤及其微生物的影响。表2列出了稻田NGC之前（A组）和之后（B组）的土壤环境因子变化。结果表明：稻田NGC通过固土和非产粮地块复耕提高了SMI，降低了FIQ。稻田NGC后，pH、SOM、AP、AK也随之增加，土壤理化性质明显改善。

表2、稻田NGC之前（A组）和之后（B组）土壤样品的基本物理和化学性质。（原文表3）

相对丰度结果发现，在稻田NGC实施前后的土壤样本中发现的细菌主要来自11个门，主要包括变形菌（27.89%）、放线菌（25.25%）和绿弯菌门（10.02%）等（图2）。在实施前后细菌相对丰度的变化方面，项目区01、02和09实施后变形杆菌（丰度最高）显著增加，其他项目区减少。放线菌在项目区03、04、08和09显著增加，但在其他项目区减少。

    绝对丰度观察到不同样品中土壤细菌总量的显著差异（图2）。通过对比NGC实施前土壤样本A01和A09中土壤细菌的绝对量可以看出，A01（种植西瓜）、A02（种植蔬菜）、A03（种植的葡萄）中土壤细菌的绝对量较高， A05（种植草莓）、A08（种植桑葚）、A4（种植蓝莓）、A06（种植梨树）、A09（种植灌木）和A07（种植茶叶）土壤细菌绝对丰度依次下降。这表明在实施NGC之前，在稻田种植不同作物对土壤细菌群落有影响。

图2、土壤样品中细菌门水平的绝对含量。（原文图3）

另一方面，稻田NGC实施前后土壤细菌绝对丰度和相对丰度的变化趋势存在明显差异。实施后土壤细菌总量（B组）高于实施前（A组），项目区05增幅最小（3.05%），项目区07增幅最大（74.18%）。项目区01、02、03、05、06、07和09项目区实施后优势门变形杆菌绝对含量显著增加，08区和04区略有下降。土壤细菌的相对丰度用于表示群落内不同细菌比例的变化，而绝对含量用于表示不同细菌数量的变化。因此，通过整合这两个指标，我们可以更全面、更准确地了解耕地NGC对土壤细菌群落的影响。

根据绝对丰度计算土壤细菌的α多样性指数，结果表明：NGC是显著影响细菌群落多样性的因素（表3）。B组（NGC实施后）土壤细菌的α多样性指数（ACE、Chao1、覆盖率、香农）明显优于A组（NGC实施前），表明稻田NGC的工程措施（如非粮地复耕、地块合并、平地、沟渠建设、有机肥施用）有助于提高土壤细菌的α多样性。

表3、稻田NGC实施之前（A组）和之后（B组）土壤细菌的α多样性指数。（原文表4）

地理位置和环境因子可能对NGC效应对耕地土壤细菌变化的机制起着关键作用。因此，采用VPA来确定NGC，环境因素地理位置的影响。结果表明，NGC、环境因子和地理位置分别对细菌有显著影响（图3）。因此，NGC、环境因子和地理位置相互作用，系统地影响着土壤细菌群落的构建过程。

图3、非粮化整治、环境因素和地理位置对土壤细菌影响的VPA维恩图。（原文图4）

环境因子对土壤细菌多样性和结构的影响

RDA分析及显著性检验表明，与样地土壤细菌群落结构密切相关的环境因子为TN、 AP 、pH 、SOM、FIQ、SMI和AK与RDA轴1高度相关（图4）。

图4、土壤细菌组成和环境因子的RDA分析。（原文图5）

Spearman相关性分析与试验表明，Fibrobacteres、OP11、GN02、WS2和Kazan-3b-28等均与TN、AP、pH、SOM、FIQ、SMI和AK存在显著相关（图5）。这些结果表明，稻田NGC改变了TN、AP、pH、SOM、FIQ、SMI和AK，进而影响了土壤细菌群落的多样性和结构。

图5、土壤细菌门与环境因子的Spearman相关系数。（原文图6）

NGC对土壤细菌功能的影响

使用PICRUSt软件预测细菌群落的相应功能丰度。Wilcoxon秩和检验结果显示，稻田NGC（B组）实施后土壤细菌功能与实施前（A组）相比显著提高，E氨基酸转运代谢、C能量产生与转化、 T信号转导机制和M细胞膜生物发生在项目实施前后显著变化，这主要是细菌种类优势变化和数量变化共同作用的结果（图6）。

图6、PICRUSt预测的稻田非粮化整治之前（白色）和之后（黑色）土壤样品的功能丰度结果。（原文图7）

综上所述，16S rDNA扩增子绝对定量测序技术的应用，结合相对丰度和绝对含量两个方面的证明，验证了稻田非粮化整治改变了土壤细菌群落结构，提高了土壤细菌多样性，将深刻影响稻田生态功能的可持续性。因此，迫切需要将土壤细菌多样性的多样性及其稻田非粮化整治的生态意义纳入耕地生态保护的研究框架和理论体系。同时，需要注意的是，由于本观测性研究仅关注了一年内稻田非粮化整治前后的变化，作者能否得出定性结果尚不确定，即本研究结果是稻田非粮化整治对土壤细菌多样性的暂时响应还是长期影响。此外，研究结果也证明了土壤环境因子与土壤细菌功能和非粮化稻田修复之间的正响应。因此，需要进一步思考土壤细菌与环境因子的耦合研究以及耕地各种生态功能的演化过程，以进一步揭示稻田非粮化整治下土壤细菌群落变化引起的水稻生态系统养分差异及其对生态功能可持续性的反馈作用， 更重要的是为优化非粮修复下土壤细菌群落多样性和水稻生态功能的可持续保护提供科学依据。

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