【天昊特色遗传病基因检测专题】#系列一：189个CNVplex探针高精准检测DMD基因大片段缺失/重复突变

【天昊特色遗传病基因检测专题】

系列一

189个CNVplex探针高精准检测DMD基因大片段缺失/重复突变

假肥大性肌营养不良

假肥大性肌营养不良，也称Duchenne型肌营养不良症（DMD）(OMIM310200)。是最常见的一类进行性肌营养不良症。患病率为3.3/10万，占出生男婴的20-30/10万，为X-连锁隐性遗传。主要是男孩发病，女性为致病基因的携带者。通常5岁左右发病。肌萎缩是进行性的，这是本病的特点，预后差。本病的发生是由于编码dystrophin的DMD基因的突变所引起，有约1/3病例为散发，没有家族史，是由基因新突变造成。Becker肌营养不良(Beckermusculardystrophy,BMD)的产生也是由于DMD基因突变所引起，通常突变后产生的异常DMD蛋白仍具有一定功能，因而临床症状较DMD轻得多。DMD基因突变包含片段缺失、重复或点突变，其中基因序列缺失或重复导致的DMD/BMD占65%~80%。

针对DMD基因突变的检测方式

DMD基因突变检测是假肥大性肌营养不良疾病确诊以及家族备孕女性成员生育风险评估的重要手段。DMD基因全长2.3Mb，有79个外显子，基因内碱基的缺失、重复或是点突变都有可能导致疾病。

目前市场上针对DMD基因突变的检测方式主要有2种：

由于大片段缺失/重复突变是主要突变方式，所以一种检测方式是先采用2个MLPA探针组（MRC Holland）供80个探针进行缺失/重复突变检测，如果没有发现这类突变，再采用常规Sanger测序或NGS富集测序完成点突变检测；

另一种方式仅采用NGS富集测序，通过优化数据分析算法完成点突变及大片段缺失/重复突变的同时检测。

但上述2种方法对大片段缺失或重复突变的检测均存在一些不足：

MLPA方法虽然是目前国际公认的多重基因拷贝数检测的金标准，但由于总共只有80个探针，平均每个外显子仅有1个探针覆盖，对于单外显子的缺失或重复检测准确性会受影响，而且探针结合处低频多态或突变的存在可能会导致单外显子缺失的假阳性结果，此外MLPA试剂盒依赖进口，成本高且检测变异大（10-20%）；

依据NGS数据进行的拷贝数计算值由于受样本质量、文库构建以及富集操作等多步骤引入的方差影响而波动较大，对于覆盖少数几个特别是单个外显子的缺失或重复突变的检测准确性普遍不高，易产生假阳或假阴性结果，检测异常结果还需其它方法进一步验证。

为此，天昊基于CNVplex^®高通量基因拷贝数检测专利技术研发了一个高精准的DMD基因大片段缺失/重复突变检测体系，相比MRC Holland的MLPA检测试剂盒来说，它具备以下检测优势:

探针的数量及分布

设计了189对探针，每个外显子至少2对，大片段缺失/重复突变的阳性判定至少有2对探针对数据的支持，检测结果更可靠，更精准，对于单外显子的拷贝数异常也无需其它方法验证；

天昊诊断_DMD探针分布图

基于数据库

CNVplex^®探针设计时，依据DMD点突变数据库信息，将探针设计在点突变的突变热点序列区，从而对于某外显子仅有单个探针发生拷贝数明显下降的情况可提示该区域存在点突变可能，预计>30%的致病点突变可通过该检测体系进行定位；

探针的设置

该检测体系在基因启动子上游0-10kb内设计了5对探针及100kb处设计了2对探针，转录终止子下游1kb内也设计了2个探针，从而对于可能影响转录起始或终止的非编码区的缺失突变也可有效检测。

检测精确

CNVplex^®探针的拷贝数检测值变异仅5-10%, 相比MLPA探针的10-20%，检测更为精确。

DMD检测效果案例图

（1）该女性样本检测到ChrX:31121865-33212065(GRCh38)杂合缺失, 片段长度大于或等于2.09Mb，涉及整个DMD基因；

DMD大片断缺失检测案例图

（2）该样本检测到DMD基因第44到47号外显子的杂合重复，可能会造成移码突变；

DMD部分外显子杂合重复检测案例图

（3）该样本检测到DMD基因第51号外显子的杂合缺失；

DMD单个外显子杂合缺失检测案例图

（4）该样本检测到DMD基因第52号外显子的杂合重复；

DMD单个外显子杂合重复检测案例图

（5）该样本检测到DMD基因中单探针的缺失，因此在测序验证中也再次验证了第7号外显子上的c.583C>T无义突变；

DMD单外显子缺失检测案例图

天昊专利技术——CNVplex^®

CNVplex^®高通量基因拷贝数检测技术是通过连接酶高特异性连接反应对目的区域进行杂交、连接，通过我司自研专利技术在连接探针末段引入不同长度的标签序列获得长度各异的目的探针连接产物，利用荧光标记的通用引物对连接产物进行PCR扩增，通过多重荧光片段分析对扩增产物进行分离检测最后通过对检测图谱分析，对样品目的区域拷贝数进行分析确定。

CNVplex^®适用于涉及到目标基因片段拷贝数变异检测的遗传学研究领域或临床检测项目，具有通量高、分辨率高、准确性高等特点；首先CNVplex^®方法可以实现1根毛细管同时对48-480个基因区段的拷贝数快速检测，检测效率极高，其次可以对6拷贝数以内的片段进行准确定量，精准分析目标基因的拷贝数变异，并且由于连接酶的高特异性的连接原理，检测区域连接产物采用通用引物扩增，扩增效率基本一致，平均检测CV<10%。

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官方网址：http:geneskybiotech.com

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