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Molecular Cancer——实体瘤中不同的circRNA特征


上海天昊生物 

 

 
环状RNA（circRNAs）是一类由反向剪接产生的具有共价闭环结构的单链内源性RNA。根据序列的起源，circRNAs主要分为三大类，即外显子circRNA、外显子内含子circRNA和内含子circRNA。近年来，circRNAs通过调控转录、吸附miRNA、作为RNA结合蛋白（RBP）诱饵以及翻译成蛋白质等多种机制，成为多种生物学过程中的重要调控因子。
越来越多的证据表明，circRNAs在癌症中通常是失调的，并在肿瘤的起始和发展中发挥关键作用。然而，在不同癌症类型中表现出一致或不一致改变的异常circRNAs仍然难以理解。为了解决这个问题，四川大学华西医院呼吸与危重症医学科李为民团队和四川大学彭勇团队合作对包括恶性胶质瘤（GBM）、食管鳞状细胞癌（ESCC）、肺腺癌（LUAD）、甲状腺癌（THCA）、结直肠癌（CRC）、胃癌（GC）和肝细胞癌（HCC）在内的7种恶性肿瘤中的122个肿瘤及其匹配的正常样本进行了核糖体去除的RNA测序。
相关研究成果于2022年3月2日在线发表在Molecular Cancer杂志上。该研究首先分析了正常组织中circRNA的组织特异性表达模式，并鉴定了不同癌症类型中异常的circRNA表达特征。此外，circRNA的组织特异性表达和异常表达是由于其宿主基因或RBP的表达所致。最后，验证了普遍下调的circLIFR在体外抑制细胞侵袭，在体内抑制细胞转移，突出了其在实体肿瘤中的抑瘤作用。


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不同癌种转录组数据中的circRNA特征
该研究收集了7种恶性肿瘤中的122个肿瘤样本及相应的非癌正常组织，并对其进行了链特异性和rRNA去除的RNA测序。使用CIRCexplorer2鉴定了circBase中注释的共59,056个circRNAs，其中53,399个（90.42%）被至少两个反向剪接序列支持（图1A）。根据基因组区域，大部分circRNAs（59,020，99.94%）来自外显子区，包括蛋白质编码序列（CDSs）和非翻译区（UTRs，图1B）。这些外显子circRNAs的长度为200-1200nt，主要由2-5个外显子组成（图1C-D）。有趣的是，22个circRNAs被发现比其同源的线性转录本表现出更高的表达，表明它们在细胞功能中发挥了重要作用。比如，来自HIPK3基因位点2号外显子的致癌circRNAs circHIPK3的表达显著高于其线性转录本（图1E）。


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考虑到这种反向剪接机制，作者也探索了circRNA的多样性，发现近73.54%的宿主基因可以产生至少2种circRNA异构体（图1F）。引人注目的是，18.83%的宿主基因可以产生超过10个circRNA异构体。此外，发现基因倾向于表达主要circRNA异构体的趋势（图1G-H）。因此，优势circRNA异构体的环化外显子侧翼的内含子更长，并且具有更多重复序列（图1I-J），这表明内含子内的序列结构可能有助于这些circRNA的形成。


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组织特异性circRNA图谱
考虑到大多数circRNAs的发现频率较低，表达水平也较低，因此作者保留了1762个丰度较高的circRNAs（至少一种组织中RPM表达的中位数为0.1），以获得高置信度的图谱。因此，将30个组织特异性指数（TSI）小于0.3的circRNAs定义为普遍存在的circRNAs （图2A），表明了它们在基本细胞过程中的重要功能。此外，研究发现了439个TSI超过0.85的circRNAs，将它们定义为组织特异性circRNAs（图2B），这意味着它们具有组织特异性功能。此外，发现大脑中组织特异性circRNAs的数量最多，而肠中最少（图2B）。然而，这些普遍存在的和组织特异性的circRNAs的功能仍然不清楚。


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宿主基因和/或RBP的组织特异性表达有助于circRNAs的组织特异性
circRNAs的组织特异性表达特征可能是其生物发生的结果。鉴于大多数circRNAs从基因位点的初级转录本加工形成，作者最初检验circRNA和其宿主基因是否显示相同的组织特异性，发现只有135个circRNAs（30.75%）由组织特异性宿主基因产生（图2C）。Pearson相关性分析进一步支持，来自组织特异性基因的circRNAs与宿主基因表现出很强的相关性（图2D），这意味着这些circRNAs的表达高度依赖于宿主基因的表达。例如，SLIAN1是一种仅在脑内表达的微管正端跟踪蛋白，调控微管动力学，促进轴突发育，因此源自SLAIN1基因的hsa_circ_0000497也在脑内高表达（图2E）。因此，宿主基因的组织特异性表达有助于这些组织特异性circRNAs的组织特异性。


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值得注意的是，304个（69.25%）组织特异性circRNAs来自非组织特异性基因，这意味着其他因素有助于它们的组织特异性。由于RBP已知在circRNA的生物发生中发挥作用，作者推测组织特异性RBP可能调节circRNA的组织特异性。根据先前的研究，选择了215个RBP来计算TSI，其中TSI超过0.85的8个RBP被鉴定为组织特异性RBP。接下来，作者分析了304个circRNAs和8个RBP之间的相关性，发现155个circRNA（35.31%）与这些RBP有很强的相关性（图2F），说明这些circRNAs的组织特异性可能受到组织特异性RBP的调控。在这些RBP中，RBFOX1被发现仅在大脑中表达（TSI = 1，图2G）。因此，以RBFOX1为例，研究其在组织特异性circRNAs生物发生中的潜在调控机制。首先，发现脑特异性hsa_circ_0070057与RBFOX1在脑内的表达有很强的相关性，而与其宿主基因的表达无关（图2G-H）。此外，RBFOX1的eCLIP-seq数据表明，RBFOX1确实与hsa_circ_0070057侧翼内含子结合（图2I），这表明RBFOX1促进了这种circRNA的生物生成。此外，脑特异性hsa_circ_0073539可能也受QKI（脑TSI = 0.86）调控，QKI是circRNA生物发生的一个众所周知的因子，而不是受其宿主基因MAN2A1的调控。总之，RBP的组织特异性表达可能在组织特异性circRNAs的生物发生中发挥重要作用。


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癌症中差异表达circRNAs的表达模式
新出现的证据表明，circRNAs在癌症中经常是失调的。作者比较了肿瘤和正常配对样本整体circRNA丰度，发现在几乎所有的癌症类型中circRNA整体丰度下调（图3A）。如图3B所示，作者也发现了各类型癌症中差异表达的circRNAs。
接下来，文章研究了这些差异表达的circRNAs是否具有癌症特异性。正如预期的那样，每种癌症都表现出独特的差异表达circRNAs模式（图3B-C）。在1209个异常表达的circRNAs中，有962个（79.57%）仅在一种癌症类型中有差异表达（图3C），这意味着它们在肿瘤发生中的癌症特异性作用。


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此外，247个差异表达的circRNAs在至少两种癌症类型中被异常表达（图3D）。在至少四种类型的癌症中发现了25个circRNAs的差异表达（图3E）。在这247个circRNAs中，187个circRNAs的表达在不同肿瘤中表现出一致的变化（图3F），这意味着它们在肿瘤发生过程中具有共同的功能。此外，60个circRNAs的异常表达在不同的癌症类型中表现出不一致的趋势（图3F），表明它们在不同的癌症中发挥着不同的作用。因此，这些异常表达的circRNAs可能在癌症类型的背景下发挥不同的功能。


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circLIFR在癌细胞中的表征及体内外功能验证
根据生物信息学分析，hsa_circ_0072309在正常组织中表现出较高的丰度，在除GBM外的的肿瘤中表达下调。由于hsa_circ_0072309来源于LIFR基因的第2-5号外显子（图4A），故称其为circLIFR。
作者设计反向引物对circLIFR的表达水平和环化进行了验证（图4B-C），并且利用RNase R消化和Sanger测序进一步证实了其环化的真实性（图4D-E）。作者利用核质分离后qPCR检测发现circLIFR主要定位于细胞质中（图4F），FISH进一步验证了该结果（图4G）。作者还评估了放线菌素D处理后circLIFR的稳定性，发现circLIFR比其线性转录本LIFR mRNA更稳定（图4H）。总的来说，这些结果表明circLIFR是一种真实的circRNA，主要分布在细胞质中，在除GBM外的肿瘤中显著下调。


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circLIFR已经被报道影响乳腺癌、膀胱癌、肾癌和胃癌的细胞功能。然而，目前尚无circLIFR在食管鳞癌、肝细胞癌、甲状腺癌和结直肠癌中的报道。作者通过体外的细胞学实验证实了circLIFR显著抑制细胞的迁移，并且在体内抑制肿瘤的转移（图5A-E）。


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为了进一步探索circLIFR的调控机制，作者利用转录组测序发现circLIFR下游影响的基因可能参与细胞粘附或上皮间质转化（EMT），因此circLIFR可能通过影响这些基因来抑制肿瘤的转移（图5F-J）。


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这项研究对来自7种恶性肿瘤的配对正常和肿瘤样本鉴定了circRNAs的表达情况。异常调控的circRNAs表现出癌症特异性表达或在癌症中共享的共同表达特征，这可能是由宿主基因和RBP的表达调控的。最后，研究通过实验验证了circLIFR下调并在肿瘤中发挥抑瘤作用。总的来说，这项研究提供了癌症中差异表达circRNAs的全面概况，并强调了circRNAs在癌症生物学中的重要作用。

 

 

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