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腰痛？椎间盘退变？来看m6A研究怎么做！


上海天昊生物 

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腰痛是造成全球经济负担的主要疾病，而椎间盘退变（IVDD）是腰痛最常见的退行性疾病[1]。在退变过程中，衰老的髓核细胞（NPCs）的活力和内部髓核（NP）的水合和蛋白多糖含量显著降低，导致NP和椎间盘的退变[2-4]。衰老的NPCs表现出细胞功能下降，导致生长因子下调和椎间盘微环境的改变[5, 6]。然而，NPCs衰老的具体机制尚不清楚。
 
多种组织和器官的老化相关疾病伴有表观遗传改变，包括染色质重塑、组蛋白修饰、DNA甲基化和非编码RNA调控等。然而，IVDD的表观遗传变化相关的研究相对有限。另外，组蛋白修饰以及表观基因组间的相互作用在IVDD中也是缺乏了解。m6A作为真核生物中转录后水平最丰富的RNA修饰，其在IVDD以及NPCs衰老过程中的作用仍不清楚。
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3月18日，华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科杨操团队和Kun Wang团队于Nature Communications杂志在线发表了题为“WTAP-mediated m6A modification of lncRNA NORAD promotes intervertebral disc degeneration”的研究，揭示了组蛋白修饰上调了甲基化转移酶复合物WTAP，进而介导lncRNA NORAD的m6A修饰促进NPCs衰老和IVDD。
 

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作者首先研究NP衰老在退变中的机制，发现退变NP组织比正常组织中衰老相关标志物表达更高。利用TNF-α建立的体外NPC退变模型和RNA测序发现TNF-α处理的NPCs伴随着细胞老化和衰老，衰老相关的标志物进一步被western blot、免疫荧光和SA-β-gal活性分析证实。对退变的椎间盘组织中NPCs进行转录组测序也发现与体外模型中差异表达基因的相似性。这些结果说明IVDD过程中NPCs的衰老状态与TNF-α处理的NPCs的衰老状态相关。
 
为了进一步探究lncRNAs的m6A修饰是否影响NPCs的衰老，作者采用甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）分析衰老的NPCs和对照样本，结果发现lncRNA NORAD的m6A修饰在衰老的NPCs显著增加，而转录本水平降低（如下图）。为了研究NORAD在IVDD中的作用，利用CRISPR/Cas9建立了NORAD KO小鼠模型，并在此基础上利用手术诱导IVDD，结果发现NORAD缺乏不仅有助于自发性IVDD的起始和进展，而且加速了小鼠手术诱导的IVDD。KO小鼠NPCs和人的NPCs体外实验均显示NORAD缺乏促进细胞衰老。


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为了解释m6A修饰的调控机制，作者分析NPCs中甲基转移酶和去甲基化酶的表达，发现WTAP在衰老的NPCs显著上调（如下图），RNA pulldown实验也证实衰老的NPCs中WTAP的增加促进了NORAD和甲基转移酶复合物之间的相互作用。此外，WTAP在人类NPCs中被siRNAs沉默可以缓解TNF-α处理后的NPCs的衰老状态。而且，WTAP的敲除消除了NORAD与METTL3和METTL14的相互作用，并消除了NORAD的高甲基化，同时部分挽救了其在TNF-α处理的NPC中的表达。这些结果表明，WTAP介导的NORAD的m6A修饰促进了NPC的衰老。


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为了确定WTAP的表达是否受到表观调控的影响，作者通过分析表观基因组数据和ChIP实验证实了组蛋白H3赖氨酸4三甲基化（H3K4me3）在衰老的NPCs中最为显著（如下图）。H3K4me3的富集标志着染色质结构的开放和可接近性。通过DNase I敏感性实验发现WTAP染色质可及性高，核小体占位少。此外，核run-on实验显示TNF-α处理的衰老NPCs中WTAP转录显著增加。为了阐明其具体的机制，进一步实验发现H3K4me3去甲基化酶KDM5a的表达在衰老的NPCs中下降最明显，KDM5a缺陷诱导人NPCs的高H3K4me3修饰促进了NPC的衰老和变性，而WTAP沉默介导的m6A甲基化减少可以消除这一变化。以上数据进一步证实了WTAP的上调是由KDM5a的降低介导H3K4me3的增加所致。


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为了解析m6A修饰在调控NORAD表达中的作用，对m6A测序进行分析发现NORAD中存在3个潜在的m6A修饰位点。通过荧光素酶报告实验及突变体构建证实了m6A修饰在NORAD中的作用（如下图），而NORAD的转录过程及转录本的转运并不受WTAP介导的m6A修饰的影响，增加的m6A修饰主要通过下调NORAD转录本的稳定性影响其表达水平。同时，进一步的实验证实NORAD稳定性的下降受到m6A reader蛋白YTHDF2的调控影响。


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虽然有研究和本研究数据表明，NORAD在体内的水平随着年龄的增长而降低，但其在NPC衰老中的具体调控机制尚不清楚。最近的一项研究报道，包括PUM1和PUM2在内的一个高度丰富的细胞质RNA结合蛋白家族PUMILIO与NORAD相互作用并影响衰老过程。作者对NORAD转录本进行FISH分析，并对PUM1和PUM2进行荧光免疫染色，结果表明NORAD和PUM1/2在NPCs中共定位和相互作用，而TNF-α可以减弱这种作用（如下图）。进一步的实验证实了野生型NPCs中过表达PUM1和PUM2可促进NPCs衰老，模拟了TNF-α处理的NPCs中NORAD功能缺失的表型。而在NORAD KO小鼠中阻断PUM1/2可以在一定程度上恢复穿刺诱导的IVD变性。这些数据表明，NORAD缺失通过负向调控PUMILIO活性导致NPCs衰老。在此基础上，作者还对RNA结合蛋白PUM1和PUM2的下游靶点进行分析验证，发现PUMILIO蛋白在转录后水平上通过抑制E2F3促进NPC衰老。


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总结以上研究内容，我们可以看到lncRNA NORAD可以被m6A修饰，这是由于WTAP的增加导致，而WTAP是通过KDM5a介导的H3K4me3修饰启动子来调控的。NORAD在椎间盘退变和NPC衰老过程中下调，而过表达NORAD在体外抑制NPC衰老。进一步研究发现，当NORAD下调时，RNA结合蛋白PUM1/2被隔离的减少，进而增加靶mRNA E2F3的降解，从而促进NPCs的衰老（如下图）。这项研究提出了一种m6A调控的NPC衰老过程的机制，揭示了中断NORAD m6A修饰或靶向NORAD/PUMILIO/E2F3轴可缓解IVDD的进展，并进一步为IVDD的治疗提供了一种潜在的表观遗传治疗策略。


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参考文献
1. Cieza, A. et al. Global estimates of the need for rehabilitation based on the Global Burden of disease Study 2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet 396, 2006–2017 (2021).
2. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature 509, 439–446 (2014).
3. Le Maitre, C. L., Freemont, A. J. & Hoyland, J. A. Accelerated cellular senescence in degenerate intervertebral discs: a possible role in the pathogenesis of intervertebral disc degeneration. Arthritis Res. Ther. 9, 1–12 (2007).
4. Silagi, E. S., Shapiro, I. M. & Risbud, M. V. Glycosaminoglycan synthesis in the nucleus pulposus: dysregulation and the pathogenesis of disc degeneration. Matrix Biol. 71-72, 368–379 (2018).
5. Lyu, F.-J. et al. Painful intervertebral disc degeneration and inflammation: from laboratory evidence to clinical interventions. Bone Res. 9, 1–14 (2021).
6. Yang, S., Zhang, F., Ma, J. & Ding, W. Intervertebral disc ageing and degeneration: the antiapoptotic effect of oestrogen. Ageing Res. Rev. 57, 100978 (2020).



 

天昊生物具有多年基因组、转录组和表观组等多组学检测与分析的经验，m6A RNA甲基化作为表观领域的一大热点，天昊生物自主设计了m6A调控因子（writers/erasers/readers）差异表达分析检测panel，还可以提供m6A修饰整体水平定量检测，并结合MeRIP-seq和RNA-seq挖掘受m6A调控因子影响的下游靶点，同时可对相关的靶点进行MeRIP-qPCR验证。生信团队亦可提供个性化的m6A数据库挖掘与生信分析内容。
 
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