胰腺导管腺癌(PDAC)是胰腺癌最常见的形式。PDAC具有高致死率，因为症状通常仅在疾病晚期出现，此时肿瘤可能局部不可切除或表现为转移性疾病。目前，PDAC是通过影像学检查来诊断的。唯一经FDA批准的PDAC生物标志物仍然是血清碳水化合物抗原 (CA)19-9。但CA19-9的疾病特异性有限，因为在其他几种伴随情况（例如胆道梗阻）中水平可能升高。
PDAC的病因复杂，已确定的风险因素包括年龄、慢性胰腺炎、糖尿病、肥胖、哮喘、血型和生活方式（例如，吸烟和大量饮酒）。这些风险因素在PDAC病因学中的作用也可以通过微生物组的改变来介导。例如，口腔卫生差和牙周炎与PDAC风险增加有关。人类胰腺拥有一些与口腔和肠道相同的微生物。在小鼠模型中，源自肠道的微生物可促成胰管的致癌作用，表明微生物组在 PDAC 病因学和进展中具有作用。然而，针对临床转化应用的 PDAC 特异性微生物组特征标记分析，仍没有进行深入研究。
本研究基于西班牙和德国人群队列，探讨了粪便和唾液菌群作为PDAC潜在诊断生物标志物的可能性。结果表明，粪便微生物用于早期检测 PDAC 的非侵入性、稳健的和有特异性的筛查方法是可行的。
英文题目：A faecal microbiota signature with high specificity for pancreatic cancer
中文题目：对胰腺癌具有高度特异性的粪菌特征分析
期刊名：Gut
发表时间：2022年3月
影响因子：23.059
本研究的实验设计如图1A所示：在发现阶段，利用宏基因组测序和16S rRNA扩增子测序，对来自西班牙的136个样本进行case–control分析，包括57名PDAC患者、50名对照参与者(CTR)和29名慢性胰腺炎(CP)患者的粪便样本和口腔唾液样本。另外，利用16S rRNA扩增子测序还对PDAC肿瘤组织(n = 23)和癌旁组织 (n = 20)样本进行检测分析。在验证阶段，对来自德国的76个粪便样本（44个PDAC患者和32个对照）进行宏基因组测序。本研究还根据来自九种疾病的 25项研究 (n=5792) 的现有数据，进一步验证了所得模型的疾病特异性。
?在控制宏基因组数据中的混杂因素时，PDAC与微生物组组成有关
由于几个 PDAC 风险因素，例如吸烟、饮酒、肥胖或糖尿病，本身与微生物组组成相关，研究者首先试图在研究人群中建立微生物组特征的潜在混杂因素，以便相应地调整分析。研究者总共量化了26个与微生物相关的临床变量的边际影响。受试者疾病状态与粪便中的群落组成有轻微但统计学显著相关（R2=0.02，p=0.001），但与唾液中的群落组成无关（R2=0.01，p=0.5）（图1B)。
图1B-C、(B) 西班牙队列中胰腺导管腺癌 (PDAC)、慢性胰腺炎 (CP) 和对照 (CTR) 粪便微生物组的基于Bray-Curtis距离的冗余分析 (dbRDA)。PDAC为红色圆圈，CP为绿色，对照为蓝色。丰富度、多样性指数(exp(Shannon)和inv(Simpson))用箭头表示。宏变量与中心的距离代表混杂效应大小。(C) ES粪便微生物组数据的 Wilcoxon结果，用来检验PDAC和对照之间分类群丰度。Y 轴是 log10（FDR 校正的p值），X 轴是倍数变化，点大小表示给定物种的相对丰度。红点表示显著差异丰富的物种。在宏基因组模型1中选择绿色和棕色物种作为PDAC的预测因子。
?高精度宏基因组分类法可以捕获 PDAC 患者特定粪便微生物组特征
在总体的群落组成水平上确定了PDAC肠道微生物组信号的存在后，研究者接下来确定了 9 个具有疾病特异性单变量关联的细菌（图1C)。在PDAC 患者的粪便中富含Veillonella atypica、 Fusobacterium nucleatum/hwasookii和Alloscardovia omnicolens，但是Romboutsia timonensis、 Faecalibacterium prausnitzii、Bacteroides coprocola和Bifidobacterium bifidum减少。相比之下，在唾液中没有检测到任何具有显著差异丰度的物种。
接下来通过拟合LASSO逻辑回归模型来建立多物种宏基因组分类方法，所获得的模型在研究人群中可以高精度区分PDAC患者和对照（'model-1'；AUROC=0.84；图2）。模型中最显著的阳性标记物种是Methanobrevibacter smithii、Alloscardovia omnicolens、Veillonella atypica和Bacteroides finegoldii。
?宏基因组分类方法与抗原 CA19-9 水平的结合提高了准确性
血清 CA19-9 抗原水平通常用于监测 PDAC 进展，也被建议作为早期诊断 PDAC 的潜在标志物，尽管报告的敏感性（0.80，95% CI 0.72 至 0.86）和特异性（0.75, 95% CI 0.68 至 0.80）中等。鉴于 CA19-9 由肿瘤直接分泌，研究者假设 CA19-9 血清水平和本研究微生物组分类方法提供的数据是互补的，并且它们的组合可以提高 PDAC 预测的准确性。结果表明，考虑CA19-9，无约束模型1的准确度从AUROC=0.84提高到了0.94，主要是灵敏度的提高（图2B）。更引人注目的是，当用CA19-9信息修正富集约束模型2时，观察到结果准确度从AUC = 0.71大幅提高到0.89（图2C）。分析还发现疾病阶段不影响基于微生物组模型的性能（图 2D）。
图2、预测PDAC的微生物组特征。(A)粪便微生物组中 27 个选定物种的标准化丰度热图。(B,C)不同模型下，PDAC与微生物特征组合的ROC曲线。(D)所有模型在不同 PDAC进展阶段的真阳性率(TPR)。
?宏基因组的分类方法在独立验证队列中的分析
为了测试观察到的微生物组特征是否在其他人群中有效，研究者在德国（DE）独立人群中验证了预测准确性（见图1）。在这个验证群体中，无约束模型1（图2B）和富集约束模型2（图2C)与西班牙人群具有可比性，甚至具有更高的准确性，无论有无结合CA19-9水平的数据，并且在疾病阶段具有相似的趋势（图2D）。接下来，研究进一步针对各种健康状况的独立公开的其他25项研究的5792个肠道宏基因组进行了验证。在结合CA19-9水平信息时，模型1预测PDAC检出率高达64%（图3）。
图3、PDAC患者粪便微生物组预测模型的疾病特异性验证。每项研究都根据健康状况进行分层，并测试模型以在给定组中以90%的特异性阈值进行预测。如果来自患有其他疾病的患者和健康个体的宏基因组低FPR则表明该模型是PDAC特有的。每组中的受试者数量以彩色圆圈表示。BRCA，乳腺癌；CRC，结直肠癌；CD，克罗恩病；CP，慢性胰腺炎；CTR，对照；LD，肝病；NAFLD，非酒精性脂肪肝；PC，胰腺癌；T1D，1型糖尿病；T2D，2型糖尿病；UC，溃疡性结肠炎；ES，西班牙人群；DE，德语人群。
?PDAC组织中含有与口腔和肠道微生物群落一致的特征性细菌
由于胰管中肿瘤的生长，胰腺分泌的改变会影响消化功能，因此可能是特征性肠道微生物组特征的基础。这意味着PDAC的进展可以间接导致微生物组的变化（即反向因果关系）。此外，胰管直接与十二指肠相通，为细菌和真菌在胰腺定植并促进致癌提供了解剖学联系。因此，研究者使用16S rRNA扩增子测序对来自研究人群的PDAC患者的所有粪便和唾液样本以及肿瘤 (n = 23) 和邻近健康胰腺组织 (n = 20) 进行分析。结果发现了丰富多样的胰腺微生物组，包括粪便微生物组中具有PDAC特征的分类群（图 4 A）。之后使用具有特异性引物的FISH，进一步验证Akkermansia spp、Lactobacillus spp、Bifidobacterium spp、Veillonella spp、Bacteroides spp和Streptococcus spp的流行率。扩增子和 FISH 数据基本是一致的（图4B-C）。
?口腔、肠道和胰腺微生物群之间的联系
接下来，研究者以使用16S rRNA 数据可获得的最高分类分辨率来追踪受试者体内唾液、粪便、肿瘤和健康组织样本的扩增子序列变体 (ASV)（图4A）。Veillonella spp在PDAC患者样本中富集。它在唾液（100%）和粪便（87.5%）样本中都非常普遍，而口腔和粪便类型也存在与肿瘤和非肿瘤组织相匹配ASV。有趣的是，结果发现肿瘤和相邻组织样本之间的Veillonella ASVs中没有在个体内匹配，这表明肿瘤内的Veillonella可能与健康组织中的不同。此外，本研究数据证实了之前的报道，即Lactobacillus spp和Bifidobacterium spp存在于PDAC肿瘤和非肿瘤组织中。对于这两个属，研究者发现其肿瘤类型对应于口腔或粪便ASV，但不是两者都对应，而来自健康组织的ASV没有与粪便样本匹配，这表明不同的胰腺亚群可能与口腔和肠道有关。
图4、不同条件下胰腺不同部分中微生物组的存在情况。(A) 根据16S扩增子数据推断，四个不同的身体部位存在不同属，包括粪便、唾液、胰腺肿瘤和健康组织样本。圆圈大小对应于每次比较可用的受试者总数（灰色，底行）或个体内匹配的扩增子序列变体（彩色）；匹配的样本类型由线连接。(B)以16S扩增子和原位荧光杂交（FISH）方法显示7个选定的胰腺组织样本（5个肿瘤和两个非肿瘤）中细菌的存在情况。(C)代表性FISH显微镜图像。
本研究结果表明，基于粪便微生物组的PDAC检测，提出的PDAC特异性微生物组特征性标记，可为早期PDAC诊断提供一种非侵入性、成本低、高效且稳健的方法，为该疾病提供了非常有前景的预防和治疗干预新方法。
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