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越来越多研究表明，肠道菌群可以影响许多远端器官疾病的发生发展，例如“肠-脑轴”、“肠-肺轴”和“肠-骨轴”等。但是还有一些其他的“肠-X轴”研究仍然不多，比如“肠道-膀胱轴”，即研究肠道菌群和膀胱免疫和/或感染状态之间直接和间接的相互作用，以及我们今天重点介绍的“肠-UTI轴”研究。
尿路感染(Urinary Tract Infections, UTI)是人类常见的细菌感染之一，其中致病性大肠杆菌(UPEC)是主要的病原体。约有20%-30%被诊断患有UTI的女性，将会经历复发性尿路感染(rUTIs)，其中一些患者每年感染可达六次以上，但染病的生物学基础和风险因素仍然不十分清楚。
肠道是UPEC的储备库，而尿路感染最常见的就是UPEC从肠道进入尿道发生的。在今天介绍的发表在《Nature Microbiology》的文章中，研究者向我们展示了UTI微生物组(UMB)项目的结果。该研究是为期一年的临床项目，研究对象为有rUTI病史的女性和一组匹配的健康女性。本研究通过纵向实验设计，采用宏基因组和宿主转录组多组学等分析方法，探索了rUTI中大肠杆菌菌株的动态变化、易感性和对宿主免疫反应的影响。
英文题目：Longitudinal multi-omics analyses link gut microbiome dysbiosis with recurrent urinary tract infections in women
中文题目：纵向多组学分析探索女性肠道微生物菌群失调与复发性尿路感染的联系
期刊名：Nature Microbiology
发表时间：2022年5月2日
影响因子：17.745
本项目开始rUTI招募15名女性rUTI患者和16名对照者参加了为期一年的研究。参与者每月在家收集粪便样本。当感染UTI时，收集患者的血液、尿液和直肠拭子样本(图1a)。研究者还对获得的367份纵向粪便样本进行了宏基因组测序和分析，这些样本来自为期一年的rUTI妇女(n = 197)和对照组(n = 170)的样本(图1b)。参与者总共发生了24次尿路感染的情况，均为患有rUTI的女性(图1b)。
图1、本研究实验设计和样本收集情况。
实验采用宏基因组和宿主转录组的多组学方法进行分析，样品收集大致过程为：1）所有参与者在12个月内每月提供粪便样本。样本在家中按照HMP2标准收集及运输保存。2）在初始登记和UTI访视期间，从每位患者中收集了总共15 ml的血液，分离PBMC。在PBMC分离过程中收集血清并储存在-80ºC，然后用于提取RNA及转录组分析的PBMC细胞沉淀也快速冷冻后储存在-80ºC。3）直肠拭子和尿液制备为在诊所收集直肠拭子，并在冰上储存< 30分钟，随后在2ml PBS中洗涤，然后在室温下以10,000g离心1ml PBS 2分钟，并去除PBS上清液。然后将细菌/粪便沉淀快速冷冻并储存在-80ºC，用于DNA提取。将中段尿液样本收集在无菌容器中，并在冰上储存< 30分钟；将10毫升尿液在室温下以10,000g离心5分钟。所得沉淀在PBS中洗涤，再次沉淀，然后速冻并储存在-80ºC。然后将剩余的1 ml直肠拭子PBS洗涤液和尿液分别进行系列稀释，并涂布在LB和MacConkey琼脂板上，在37℃孵育过夜后进行细菌计数定量，之后刮取平板上的细菌以收集细菌副产物，用PBS洗涤细菌细胞，离心后快速冷冻，然后储存在-80ºC，用于DNA提取。
rUTI患者肠道缺乏丰富的和产生丁酸盐的微生物
rUTI患者和对照组间的肠道菌群组成存在着较大差异(图2a-c)。研究者用个体水平的随机效应拟合线性混合模型，来确定其多样性和组成的差异。患有rUTI的女性的肠道微生物丰富度显著较低(图2c)。在门分类水平，研究者发现rUTI妇女中Bacteroidetes相对丰度升高，Firmicutes降低。之后确定了22个有差异丰度的分类群，其中16个在患有rUTI的妇女中减少(图2b)。
在rUTI患者肠道中减少的几种微生物分类群包括Faecalibacterium、Akkermansia、Blautia和Eubacterium hallii，这些都与短链脂肪酸(SCFA)的产生有关，包括丙酸盐和丁酸盐。SCFA通过促进肠道屏障功能和免疫调节在肠道中发挥抗炎作用(图2d)。可见，产生SCFA的微生物，特别是产生丁酸盐的微生物，在患有rUTI的妇女中明显较少(图2d)。但是不同组群之间的大肠杆菌平均相对丰度没有显著差异(图2e)。
图2、患有rUTI女性具有特有的肠道菌群。
不同宿主免疫反应可能与rUTI有关
研究者从在招募和UTI收集的血液样本中探索了免疫学生物标记，量化了(1)一组涉及炎症和T细胞活化的人类细胞因子、趋化因子和生长因子，以及(2)细胞类型和外周血单核细胞(PBMCs)的转录活性。结果并没有观察到大范围的组间差异。然而，研究者发现两个基因在rUTI队列的PBMCs中上调：ZNF266和长非编码RNA LINC00944。这些以前报道过与泌尿系统健康有关。
肠道和膀胱中大肠杆菌动态在不同组别之间是相似的
研究者利用StrainGE工具分析队列人群粪便宏基因组中大肠杆菌菌株水平的多样性，并对菌株进行分类(图3)。在rUTI和对照人群中，结果发现携带模式是相似的。每份样品的菌株数量和系统群分布在组群之间进行了比较(图4)。虽然大多数大肠杆菌菌株(62%)仅在一个样本中被观察到，但22%的菌株是“长久存在的”，其携带者至少在四分之一的样本中被观察到。对尿液宏基因组毒力因子分析显示，UTI致病菌株富含毒力因子。然而，由于到达膀胱的大肠杆菌菌株的表型差异在基因组比较中并不明显，细菌侵入膀胱后的临床结果仍可能出现差异。rUTI生态失调可能对UPEC基因表达有影响。已经有实验表明，较高的SCFA水平与大肠杆菌毒力因子的下调有关。
抗生素治疗未能清除肠道中的UTI致病菌株。虽然众所周知，尿路感染最常见的是由肠道中的UPEC引起的，但是这些菌株在肠道中的纵向动力学还不太清楚，尽管这种认识对于预防rUTI的发展非常重要。本研究将菌株应用于所有尿样，以确定UTI致病菌株及其肠道动力学，特别是在UTI时期和抗生素后。对来自UTI的尿液样本和培养的直肠拭子的测序进行比较后发现，几乎所有的大肠杆菌尿路感染都含有相同的UTI菌株，这反映了频繁的肠道到膀胱的传播结果。使用抗生素后，大肠杆菌菌株在粪便样本中的检出率显著降低。然而，在后来的时间点再次观察到许多明显被抗生素清除的菌株；事实上，在接触抗生素后，肠道中观察到的UTI致病菌株没有一个被永久清除。这表明在膀胱和肠道的抗生素清除后，UTI的菌株可能重新引入肠道。
图3、rUTI患者中频繁的肠道-膀胱传播和持久性分析。
图4、所有粪便和尿液样本中鉴定大肠杆菌菌株的系统发育分布图。
我们确定了(1)与健康对照组相比，有rUTI病史的女性有一个独特的、多样性较低的肠道菌群，丁酸盐产生微生物减少，并表现出低水平炎症的特征；(2)差异免疫生物标志物提示UTI女性可能具有独特的免疫状态；(3)在两个队列中，大肠杆菌菌株从肠道传播到膀胱，尽管在健康对照组中没有出现UTI症状；(4)引起UTI的大肠杆菌菌株经常持续定居在肠道中，并且不能通过反复暴露于抗生素而被永久清除。因此，对rUTI的易感性部分是通过涉及肠-膀胱轴的综合征介导的，该综合征包括丁酸盐产生减少和全身免疫明显改变的肠道菌群失调。结果表明，尽管进行了抗生素治疗，UPEC菌株仍然存在于肠道中，这本身可能会加剧肠道生态失调。
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