杂志：The American Journal of Human Genetics （IF 11.68） 研究对象：肺癌
思路：
1、选基因：MAPKAPK2
        分析肺癌的环境因素包括：吸烟，空气污染，放射性损伤，这些因素都会刺激细胞从而激活MAPK 通路（该通路调控细胞凋亡、炎症反应和肿瘤发生），因此该通路中基因发生变异会影响癌症的发生。MAPKAPK2 属于p38 MAPK 通路（参与调控细胞外信号，包括氧化应激、辐射、炎症、基因毒性和感染），已有研究证实MAPKAPK2 基因参与致癌和肿瘤生长及侵袭，因此我们推测MAPKAPK2 基因变异会影响患癌风险和预后。

PS：注意分析自己研究疾病的参与通路，积极利用已有研究成果做参考并作合理推测

2、明确检测区域：
        参考数据库Database of Genomic Variants (DGV）查询结果显示，MAPKAPK2 基因上曾经报导过3 个CNV：g.CNV-2091（频率15/269 =0.055 ），g.CNV-30450（频率6/30 = 0.20），g.CNV-71062（频率1/39=0.026 ）。考虑到频率的情况，最终仅选择g.CNV-30450 （频率6/30= 0.20）作为研究区域，该区域位于基因的启动子区，跨度1.7K。

PS：参考数据库挑选目的区域，参考时注意数据库里的CNV 报道大部分来自芯片结果，并要注意种族和疾病背景等信息。文章提及的信息并不完全，可能的思考过程还有：该基因所在区域涉及拷贝数变异大小为：206.9M Variation_2091 涵盖4 个基因，因此实际发生在MAPKAPK2 基因上的拷贝数变异频率可能更低
 
 
 

CNV	区域内已知基因	技术方法	参考文献	缺失或重复
Variation_2091	IL10, IL19, IL20,MAPKAPK2	BAC Array CGH	Locke et al. (2006) PubMedID:16826518	重复15|269
Variation_30450	MAPKAPK2	Agilent Custom CGH Arrays	Perry et al. (2008) Pub Med ID:18304495	重复6|30
Variation_71062	MAPKAPK2	NimbleGen custom 42M oligo array CGH	Conrad et al. (2009) Pub Med ID:19812545	缺失1|39

3、样本采集：
       至少分三个梯队（南部2112+东部1126+南部1551），样本梯队1 用于初步筛查，样本梯队2 和3 则用于验证，此时的结果才更具有代表性和真实性。

4、检测技术：
       采用1 种方法筛查，经过不同技术进行验证结果的一致性
       TaqMan real-time quantitative PCR (qPCR) Applied BioSystems (catalog no. Hs01173160,
       AccuCopy assay(a multiple competitive real-time PCR) by Genesky Bio-Tech (Shanghai, China)
       Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0

PS：2 种不同方法相互验证即可，至于文章中SNP Array 6.0 ，我想应该是作者的科研团队恰好有这方面数据而不是特意为验证而做一批芯片检测

5、筛查结果：
      4拷贝：增加患肺癌风险，并且预后不良，生存期短

PS：一期检测患肺癌风险，后续增加临床预后样本（1137+296+331）。OR 值和P 值结合起来看

6、功能验证：
      因为检测的区域人群分子流行病学结果显示拷贝重复有统计学意义，而该区域位于MAPKAPK2 启动子区，值得在功能学上进行验证和解释。
      luciferase assays：双荧光素酶报告载体，3 个人细胞系16HBE, A549, and NC1-520
     mRNA和蛋白定量：SYBR-Green real-time PCR 和western blot，32 例初期肺癌组织