英文题目：Diversity of Bacteria at Healthy Human Conjunctiva
中文题目：健康人眼结膜处的细菌多样性
期刊名：Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.     IF：3.427 
技术：扩增子测序，V3-V4区
材料：为了尽量减少性别，年龄，种族的变化，选择四名健康的非拉美裔，白人，26-48岁的男性志愿者。志愿者信息包括性别、年龄、一般健康状况、眼部健康状况。这些志愿者没有戴隐形眼镜，没有眼部疾病、眼外伤/移植医疗记录，近期（6个月）没有抗生素治疗史。在双眼的下眼睑结膜使用干的小棉拭子采样2-3次，每个志愿者获得241 ng总DNA的混合样本。为了检查结膜黏膜层是否含有不同的微生物群落，在初始采样后的1周对一个志愿者用湿棉签对睑板结膜进行重采样。
研究背景:
        眼表（OS）微生物菌群容易引起眼睛感染和自身免疫性疾病。利用传统的培养方法分析眼睛表面的菌落结构是非常困难的，因此本研究的目的是利用扩增子测序解析眼睛表面的微生物组成。
研究结果：
来自眼表样本的16S rRNA基因序列
        平均每个样本产生了16800个16S rRNA reads。去除低质量的序列以后，共得到115003个高质量reads（平均长度为236bp）。稀释性曲线分析表明每个结膜样品的测序深度已经足够，不太可能发现新的OTU。平均而言，可以将得到的16S序列的87.9%归类到门水平（图1A），69.3%的16S序列归类到属级（图1B）。每个志愿者平均得到221个OTUs（表1）。有意思的是 RDP-II 分类器不能将31%的序列归类到属水平(图1B)，表明它们可能属于新的细菌。这些新的细菌菌种在个体间存在显著变化(图1C)。

睑结膜细菌群落的组成       
        所有的DNA序列代表五个细菌门，其中变形菌门（64%），放线菌（19.6%），和厚壁菌门（3.9%）合计占所有序列的87.9%（图1A）。其它两门，蓝细菌门和拟杆菌门被发现在污染水平数量范围内（分别为0.21%和0.16%），因此，这些细菌不被认为是正常的眼微生物成分而被排除。在属水平，所有reads的69.3%被归类为59种不同的细菌属。其中12个属在志愿者中普遍存在，其中五个：假单胞菌、根瘤菌、丙酸杆菌、不动杆菌和棒状杆菌是最丰富的，占所有reads的58%和已知细菌分类序列的92%（图1B）。
        与经常被报道的结果一致，眼表面的共生细菌群体主要有葡萄球菌革兰阳性种，棒状杆菌，丙酸杆菌和链球菌。因此，我们发现的眼表微生物多样性的不同和更复杂的菌落结构是令人震惊的。根据PubMed搜索，分类到的59个细菌属中有42个在之前健康眼睛中没有报道。眼表面微生物不同于口腔，主要包括厚壁菌门（奈瑟氏菌属和链球菌属），也不同于呼吸道，其主要包括放线菌（棒状杆菌，浅黄金杆菌，红球菌属）。同时，眼表面微生物群落与皮肤相似，主要是在变形菌门上富集。
         需要强调的是这个数据比传统培养在属水平揭示了更大的物种多样性。之前的微生物学调查发现眼表面葡萄球菌，丙酸杆菌和棒状杆菌属的检出率最高。相反16S rRNA测序铜绿假单胞菌、丙酸杆菌和根瘤菌属的检出率最高，只有4%葡萄球菌被检出。这两种方法得到不同结果反映了一个事实，传统培养偏向检测出快速增长的细菌，即很容易在基础培养基上生长的细菌。
眼表面核心微生物组
         分析结果显示59个属中有12个在所有受试者中普遍存在，这些属被认为是眼表面的核心微生物组（图1B）。最普遍的10个属包括铜绿假单胞菌（20%）、丙酸杆菌（20%），慢生根瘤菌（16%）、棒状杆菌（15%），不动细菌属（12%）、单胞菌属（5%），金黄色葡萄球菌（4%）、Aquabacterium（2%）、鞘氨醇单胞菌（1%），和链球菌属（1%）。
个体变异性和环境的潜在贡献
         流行属在这四个个体间有显著的变化（图2），一些受试者表现出单一主导属，例如棒状杆菌占受试者2所有OUT序列的47%，假单胞菌占受试者4所有OUT序列的69%。这种被单一菌属主导的现象实际上不只发生在眼睛中，在皮肤上也存在这样的现象。

 
        尽管个体间存在差异，但是12个细菌属在所有受试者中普遍存在（图3），这是因为眼表面相对于其它生态位较少暴露于外部，所以个体之间的变化似乎只影响这些核心微生物菌种的相对丰度，而不是这个核心微生物群落的组成。然而个体间的差异不能排除与附近人类微生物群落的物理相互作用，包括在眼睑边缘的皮肤或手，此外，接触空气中的灰尘颗粒和受污染的水也可能会导致外源性微生物物种，这些可以解释研究对象不同环境细菌的来源，例如，短根瘤菌属是眼结膜中第二最丰富的菌属，而值得注意的是短根瘤菌属是原生动物变形虫常见的共生菌，并且已知原生动物变形虫可通过污染水龙头水和空调系统来感染肺部和眼睛，因此短根瘤菌属作为变形虫常见的共生菌感染了眼部。

 
结果总结：
        1.  每个志愿者平均有221个OTU。细菌群落可归类为5个门和59个不同的属。31%的DNA序列不能够归类，可能是新的细菌。
        2.  受试者间结膜微生物结构差异十分显著。
        3.  12个属：假单胞菌属、丙酸杆菌属、短根瘤菌属、棒杆菌属、不动杆菌属、短波单胞杆菌属、Aquabacterium、葡萄球菌属、假平胞菌属、链球菌属、Streptophyta和甲基杆菌属在所有受试者中普遍存在，被认为是眼结膜的核心微生物组。
        4.  流行属在这四个个体间有显著的变化，一些受试者表现出单一主导属。
        5.  出乎意料的是，健康人结膜包含有很多被认为是结膜表面致病菌的微生物。