祝贺！天昊Accu16S细菌绝对定量技术助力客户头颈癌研究新发现

近日，上海复旦大学附属眼耳鼻喉科医院周梁教授团队在《Journal of Oral Microbiology》杂志上发表了重要研究成果。该项研究发现，QMP比RMP具有更全面的结果。在OPM组中发现了菌群生态失调现象，Parvimonas、Fusobacterium和Dialister被认为是晚期HPSCC的危险因素。

在本研究中，天昊生物提供微生物Accu16S^®细菌绝对定量测序及相关分析服务，该方法可以同时获得RMP和QMP分析结果。

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英文题目：Cross-comparison of microbiota in the oropharynx, hypopharyngeal squamous cell carcinoma and their adjacent tissues through quantitative microbiome profiling

中文题目：利用定量微生物图谱分析来比较口咽、下咽鳞状细胞癌及其邻近组织中的微生物

期刊名：Journal of Oral Microbiology

发表时间：2022年5月10日

影响因子：5.474

本研究成功收集了27名HPSCC患者的下咽癌组织(HC)、癌旁组织(AT)和口咽粘膜拭子(OPM)这三种不同的样本。取样方法参考美国国立卫生研究院人类微生物组项目 (http://hmpdacc.org/doc/HMP_Clinical_Protocol.pdf)，使用两个拭子(FLOQ Swabs, COPAN)对口咽粘膜(OPM)上的微生物进行采样，刮取共20 mg的癌及癌旁组织，样品快速储存在-80ºC，用于DNA提取。

收集好的样本用干冰运输到公司，利用天昊微生物Accu16S^®细菌绝对定量测序方法，进行微生物的QMP绝对定量和RMP相对定量分析，具体选取16S rRNA基因的V3-V4区进行检测。

27名HPSCC患者样本中，QMP共检测到5404个ASV，注释到185个门、179个纲、178个目、176个科和172个属。RMP共检测到2816个ASV，涵盖了126个门、123个纲、122个目、121个科、118个属。

在门和属水平上，研究发现QMP和RMP中微生物群的不同组成。QMP中，OPM组的微生物数量远高于HC。与HC和OPM相比，AT组的微生物组在门和属的基础上含量最低（图 1A-B）。基于属的微生物群组成的饼图在RMP和QMP之间也有所不同（图1c-h）。

图1、下咽癌组织(HC)、癌旁组织(AT)和口咽粘膜拭子(OPM)样本的微生物相对含量和绝对含量组成情况。(a)门水平柱状图。(b)属水平柱状图。这三组中ASV的数量呈现显着差异。饼图描述了RMP (c-e)和QMP(f-h)中属的不同比例。

QMP成分中α多样性的解释与RMP分析略有不同。在 RMP 组内发现的微生物群落丰富度存在显着差异，但在QMP分析中组间没有差异。在b多样性分析中，RMP和QMP都显示出相同的趋势。通过使用RMP和QMP数据矩阵，对HC组中相关分类单元从低到高的25个常见属进行提取和重建，建立相关性（图2）。

图2、微生物相对丰度与绝对丰度的网络重建图。使用QMP（上三角）和RMP（下三角）对HC组中共有25个常见微生物进行了交叉验证。分类群按其QMP丰度和DNA计数之间相关性的显着性排序。相关系数通过Spearman分析并使用不同颜色和大小的圆圈表示，蓝色为正相关；红色为负相关。（原文图3）

利用物种观察值、ACE指数和香农指数，对QMP和RMP的微生物α多样性进行比较分析。RMP表明，与AT组相比，HC组中观察到的物种、ACE指数和香农指数下调。然而，在QMP中，只有香农指数发现HC 中微生物群的多样性降低。在β多样性分析中，QMP的Bray-Curtis距离分析表明HC组和AT组之间的微生物群存在显着差异，而QMP和RMP的加权UniFrac距离分析在组间没有这种差异。LEfSe分析表明，HC组中Streptococcus、Fusobacteriale和Bacteroidales较高，而Acinetobacter、Paracoccus、Chryseobacterium和Propioni bacterium较低。

我们假设OPM的微生物也是HC的来源。RMP的α多样性分析中，我们无法确定HC和AT组的丰富度和均匀度的变化。但在QMP中，与AT相比，HC中微生物群的丰富度下调。基于加权UniFrac和Bray-Curtis的PCoA和NMDS均表明HC的多样性显着高于OPM组（图3a-d）。LEfSe分析表明，HC组中Atopobium、Sphingomonas和Vibrionimonas较高，而OPM组中Veillonella、Streptococcus、Granulicatella和Rothia的丰度较高(图3e-f）。分析还发现Fusobacterium、Porphyromonas、Haemophilus和Peptostreptococcus的HC和OPM之间存在正相关关系（图4）。

图4、QMP中HC和OPM的相关性热图。通过Spearman相关分析，筛选出HC中绝对丰度高的前15个属，并与OPM进行相关性比较。（原文图7）

结合常见的临床诊断结果，研究者发现差异微生物群的绝对丰度似乎与生物多样性的变化有关。与早期分类 (T1-2)相比，在后期T分类(T3-4)中，Prevotella、Solobacterium、Fusobacterium和Parvimonas的绝对丰度增加，而Pseudomonas则下调（图5a-f）。在 TNM 分期中，与II-III期相比，IV 期在属水平的Treponema、Parvimonas、Dialister、Fusobacterium、Solobacterium和Slackia显示增加(图5g-l）。

利用PICRUSt2方法进行功能预测分析。与AT组相比，OPM和HC组均显示微生物群可以参与如代谢过程、DNA复制和损伤、多种氨基酸的生物合成等途径，从而可能促进癌的进展。

与HC和AT组相比，OPM组的菌群呈现出多样性较低的特点。QMP补充了传统的RMP结果，发现了与RMP相反的结果，展示了其全面性的优势。在QMP分析下HC组进行分类，发现在晚期T分类和TNM分期中，属水平的存在更多的Fusobacterium、Parvimonas和Dialister。综上表明，口咽拭子可能是一种有用的非侵入性替代活检的方法，用于HPSCC中微生物的评估。